ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ РОСМЕДТЕХНОЛОГИЙ»
	УТВЕРЖДАЮ Директор ФГУ «ГНИЦ ПМ Росмедтехнологий» академик РАМН, профессор __________________ Р.Г.Оганов “___”_________________ 2009 г.
ОТЧЕТ по изучению фармакокинетики препарата Ливарол (ОАО “Нижфарм”, Россия) у здоровых добровольцев
Москва – 2009 ФГУ «ГНИЦ ПМ Росмедтехнологии»

ОТВЕТСТВЕННЫЕ ИСПОЛНИТЕЛИ:

Руководитель отдела профилактической фармакотерапии ФГУ «Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины Росмедтехнологии», чл.-корр.РАЕН, профессор, д.м.н. С.Ю.Марцевич

Руководитель лаборатории фармакокинетики ФГУ «Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины Росмедтехнологии», канд. биол. наук В.Г.Белолипецкая

РЕЗЮМЕ

У 4 здоровых добровольцев-женщин изучена фармакокинетика суппозиториев Ливарол (действующее вещество – кетоконазол) производства ОАО «Нижфарм» (Россия) после однократного введения в дозе 400 мг (1 суппозиторий) в условиях, максимально приближенных к реальной клинической практике (в положении «лежа»). Концентрацию неизмененного кетоконазола в плазме крови определяли методом ВЭЖХ с УФ-детектированием. Установлено, что кетоконазол практически не всасывается при применении препарата Ливарол производства ОАО «Нижфарм» (Россия).

ВВЕДЕНИЕ

Кетоконазол – синтетическое производное имидазол диаксолана:

Активен в отношении дерматофитов, дрожжевых грибов (Torulopsis), возбудителя разноцветного лишая (Pityrosporum orbiculare), возбудителей системных микозов (Cryptococcus spp.), диморфных грибов, возбудителей некоторых дерматомикозов (Trichophyton spp., Epidermophyton floccosum, Microsporum spp.), возбудителей кандидоза (Candida spp.), высших грибов (эумицетов), а также в отношении грамположительных кокков (Staphylococcus spp., Streptococcus spp.). Механизм действия заключается в ингибировании синтеза эргостерола и липидов мембраны (триглицеридов и фосфолипидов), необходимых для синтеза клеточной стенки грибов (грибы теряют способность к образованию нитей и колоний), и нарушении проницаемости клеточной стенки. Ингибирует образование андрогенов.

При приеме внутрь абсорбция – высокая; время достижения Сmax – 1-2 ч. Биодоступность находится в прямой зависимости от величины принятой дозы. Связывается с белками плазмы крови и эритроцитами. Динамика концентрации в крови описывается биоэкспоненциальной кривой. Способен проникать в спинномозговую жидкость. Подвергается биотрансформации в печени (окислительное о-дезоксилирование, окислительная деградация, ароматическое гидроксилирование). Т1/2 первой фазы – 2, второй фазы – 8 ч. Выделяется с желчью (57%) и с мочой (13%). При наружном применении кетоконазол не всасывается и не поступает в системный кровоток, не определяется в плазме при длительном применении, поэтому системные эффекты не ожидаются.

Целью настоящего исследования является изучение фармакокинетики препарата кетоконазола – суппозиториев вагинальных Ливарол, производства ОАО «Нижфарм» (Россия) в условиях, максимально приближенных к реальной клинической практике (в положении «лежа»). Для сравнения использованы хроматограммы плазмы крови здоровых добровольцев, получавших препарат Низорал, таблетки, производства «Янссен-Силаг Н.В.» (Бельгия).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выбор здоровых добровольцев

За 14 дней до госпитализации добровольцы были подвергнуты стандартному клиническому и лабораторному обследованию с целью дальнейшего допуска к участию в исследовании. Всего в исследование было включено 4 женщины, средний возраст которых составил 29,9 ± 7,1, средний рост – 165,3 ± 5,9, средний вес – 64,7 ± 9,2 (таблица 1).

Таблица 1. Основные антропометрические и демографические данные добровольцев, включенных в исследование

№ п/п	Ф.И.О.	Возраст (лет)	Рост (см)	Вес (кг)
8	КМК	35	175	65
14	КОВ	32	162	65
15	КОВ	26	171	73
16	ММВ	38	158	67
Mean		32,8	166,5	67,5
SD		5,1	7,9	3,8
max		38	175	73
min		26	158	65

Критерии включения в исследование:

• возраст 18 - 45 лет;
• верифицированный диагноз «здоров»: отсутствие патологии со стороны желудочно-кишечного тракта, печени, почек, сердечно-сосудистой системы, ЦНС (предварительно проведенные стандартные клинико-лабораторные и инструментальные исследования не выявили наличия каких-либо заболеваний);
• масса тела не выходит за пределы ± 15 % по весо-ростовому индексу Кетле;
• отрицательный тест на беременность и согласие придерживаться адекватных методов контрацепции (в случае использования гормональных контрацептивов, они должны быть отменены не менее чем за 2 месяца до начала исследования);
• наличие письменного согласия добровольца на включение в исследование.

Критерии исключения из исследования:

• отягощенный аллергологический анамнез;
• лекарственная непереносимость;
• хронические заболевания сердечно-сосудистой, бронхолегочной, нейроэндокринной системы, а также заболевания желудочно-кишечного тракта, печени, почек, крови;
• хирургические вмешательства на желудочно-кишечном тракте (за исключением аппендэктомии);
• острые инфекционные заболевания менее чем за 4 недели до начала исследования;
• регулярный прием лекарственных препаратов менее чем за 2 недели до начала исследования;
• прием лекарственных препаратов, оказывающих выраженное влияние на гемодинамику, функцию печени и др. (барбитураты, омепразол, циметидин и т.д.), менее чем за 2 месяца до начала исследования;
• желание добровольца прекратить свое участие в исследовании;
• донорская сдача крови (450 мл крови или плазмы и более) менее чем за 2 месяца до начала исследования
• участие в I фазе клинического испытания препаратов менее чем за 3 месяца до начала исследования;
• прием более чем 10 ед. алкоголя в неделю или анамнестические сведения об алкоголизме, наркомании, злоупотреблении лекарственными препаратами;
• курение более 10 сигарет в день;
• медицинские показания, возникшие в ходе исследования;
• несоблюдение добровольцем правил участия в исследовании.

2. Изучаемый препарат

Международное непатентованное название: кетоконазол

Препарат тестируемый (Т): Ливарол суппозитории по 0,4 г производства ОАО «Нижфарм», Россия. Серия препарата 381207, срок годности – до 01.2010.

3. Протокол проведения исследования

В день исследования добровольцы прибывали к 8 часам утра в Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины (последний прием пищи – не позднее 20 часов накануне). Врач, руководящий исследованием, проводил клиническое обследование, измерял параметры гемодинамики – систолическое и диастолическое артериальное давление (САД и ДАД соответственно) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) – и делал запись в индивидуальной карте добровольца.

Добровольцы были проинформированы о том, что во время всего исследования они должны соблюдать стандартный режим: не подвергаться физической и психической нагрузке, не употреблять спиртные напитки, кофе, чай и цитрусовые соки, а также не принимать никакие другие лекарственные препараты. В обязанности добровольцев также входило информирование врача-исследователя о любых изменениях режима и самочувствия во время и после проведения фармакокинетического исследования.

После получения полной информации о ходе исследования, при наличии письменного согласия волонтера, наличии у него всех критериев включения и отсутствии критериев исключения, проводилось страхование добровольца в соответствии с требованиями клинических испытаний, а затем доброволец госпитализировался в специальную палату 1-го клинического (кардиологического) отделения ГНИЦ ПМ на 1 сутки.

Приблизительно в 9 часов утра волонтерам вводили один суппозиторий Ливарола. Дата введения исследуемого препарата (госпитализации) запротоколирована. Суппозитории добровольцы вводили под контролем процедурной сестры согласно инструкции в положении «лежа на спине». Добровольцам запрещалось вставать еще в течение минимум 4 часов, имитируя таким образом наиболее частую клиническую ситуацию – применение препарата на ночь.

Для отбора крови использовали разовые кубитальные катетеры (0-10 час) и одноразовые шприцы (24 час). Первые 4 часа после введения суппозиториев кровь отбиралась в палате в положении лежа. Образцы крови отбирались из локтевой вены в количестве 5 мл в стеклянные пробирки с добавлением гепарина в дискретные интервалы времени в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2. График отбора проб крови

№ пробы	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Время после приема препарата (час)	0	1	1,5	2	2,5	3	4	5	7	10	24

Пробы центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин, полученную плазму хранили при (-35°С) до анализа. Стабильность концентрации кетоконазола в плазме крови при (-35°С) в течение 1 месяца подтверждена экспериментально – в контрольных образцах плазмы с известным содержанием кетоконазола убыль определяемого вещества в течение всего срока хранения не наблюдалась.

Питание добровольцев, начиная с обеда, осуществлялось в соответствии с графиком питания стационара.

4. Аналитические методы определения неизмененного кетоконазола в плазме крови здоровых добровольцев

Концентрацию неизмененного кетоконазола в плазме крови добровольцев определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием.

В работе использовали субстанцию кетоконазола, предоставленную фирмой – производителем.

Матричные растворы кетоконазола с концентрацией 1 мг/мл готовили с использованием метанола, из этих растворов готовили растворы стандартных образцов.

Для экстракции и элюентов использовались ацетонитрил, CuSO4, дигидрофосфат калия производства “Merck” (ФРГ). Вода – двухступенчатая очистка обратным осмосом и деионизированная (Millipore, Франция).

Подготовка проб плазмы для анализа

Для выделения кетоконазола и очистки экстракта к 0,50 мл сыворотки добавляли 50 мкл 5% водного раствора CuSO4 и 450 мкл ацетонитрила, встряхивали на vortex 5 минут и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут. Отбирали надосадочную жидкость и аликвоту 50 мкл прозрачного раствора вводили в хроматограф. Степень извлечения кетоконазола в указанных условиях составила 95,5 ± 3,2

Хроматографическое определение

Анализ проводили на жидкостном хроматографе «KNAUER» (Германия), оснащенном автосамплером «Triathon 3800» и спектрофотометрическим детектором (К-2501) при 231 нм в изократическом режиме. Колонка – Kromasil 100-5-C18, 4.6*150 mm, 5μm. Температура разделения – 200С. Скорость потока – 1,0 мл/мин. Объем вводимой пробы – 50 мкл. Подвижная фаза состояла из 0,25 мМ KH2PO4 (рН=4,5) и ацетонитрила в объемном отношении 50:50. Время удерживания кетоконазола в этих условиях составило 5,4 мин.

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки с использованием программного обеспечения фирмы «Eurochrom 2000». Калибровочную кривую получали в результате анализа проб сыворотки с добавками известных количеств стандарта определяемого соединения. Калибровочная зависимость носила линейный характер в диапазоне концентраций 0,10 – 15,00 мкг/мл и описывалась уравнением:

С = 4,23S + 0,0934, (r² = 0,998848).

где S – площадь хроматографического пика, С – концентрация кетоконазола (мкг/мл).

Минимальная обнаруживаемая концентрация кетоконазола составила 0,05 мкг/мл. Образцы хроматограмм представлены на рисунках 2 и 3, калибровочный график – на рисунке 4, метрологические характеристики методики – в таблице 3.

Таблица 3. Метрологические характеристики метода определения кетоконазола

Введено (мкг/мл)	Найдено (мкг/мл)					Mean	SD	SE	CV
Inter-day
5,000	5,15	4,90	4,69	4,56	4,57	4,77	0,25	0,11	5,25
Intra-day
5,000	4,45	4,90	5,05	5,09	4,71	4,84	0,26	0,12	5,46

Рис. 2. Хроматограмма интактной плазмы крови добровольца.

Injection Date : 25/11/08
Column : Kromasil 100-5-C18, 4.6*150 mm, 5um.
Mf. : KH2PO4 Buffer:AcN= 50:50
Flow : 1.0 ml/min
Temp. : 200C
UV : 231 nm
Inj. Volume : 50 ul
Sample name : serum
Method : C:\DATA\1\Methods\ket3_1_231

Рис. 3. Хроматограмма плазмы крови добровольца, получавшего Низорал.

Injection Date : 26/11/08
Column : Kromasil 100-5-C18, 4.6*150 mm, 5um.
Mf. : KH2PO4 Buffer:AcN= 50:50
Flow : 1.0 ml/min
Temp. : 200C
UV : 231 nm
Inj. Volume : 50 ul
Sample name : N 5
Method : C:\DATA\1\Methods\ket3_1_231

Рис. 4. Калибровочный график кетоконазола

Date : 25/11/2008
Calculate : External standard
based on : Peak area
Curve type : Linear
Calibration table

Ketoсonazol	Concentr. [ug/ml]	Area [mAU*min]	Ret.time [min]
1	15	3,57449	5.422
2	10	2,32143
3	5	1,03025
4	1	0,239412
5	0,5	0,145777
6	0,1	0,031635

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Фармакокинетический анализ

При применении суппозиториев Ливарол, кетоконазол детектировался в одной пробе у 2 добровольцев на уровне предела обнаружения (0,05 – 0,07 μг/мл), т.е. в десятки раз ниже, чем при применении таблеток Низорал.

Фармакокинетические параметры при введении Ливарола у добровольцев не рассчитывались, принимая во внимание невозможность построения фармакокинетических кривых при столь низких показателях (на уровне предела обнаружения и ниже).

2. Анализ побочных эффектов

Нежелательные явления при однократном введении суппозиториев Ливарол четырем добровольцам в положении «лежа» не наблюдались.

З А К Л Ю Ч Е Н И Е

На основании полученных данных можно сделать вывод, что лекарственное средство Ливарол, суппозитории вагинальные 0,4 г, практически не всасывается при вагинальном применении у здоровых женщин.

ЛИТЕРАТУРА
1. Агафонов А.А., Пиотровский В.К.. “Программа M-IND оценки системных параметров фармакокинетики модельно-независимым методом статистических моментов”. Хим.-Фарм. журнал.-1991- 10 - c. 16.
2. Проведение качественных исследований биоэквивалентности лекарственных средств. Методические указания. Москва – 2004.
3. Sunil Bajad, R. K. Johri, K. Singh, J. Singh and K. L. Bedi Simple high-performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of ketoconazole and piperine in rat plasma and hepatocyte culture // International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques No25, Maastricht , PAYS-BAS(17/06/2001), 2002, vol. 949, no 1-2 (377p.) (15ref.), [Notes: Part II], p. 43-47.