Экспериментальное изучение влияния препарата Септолете плюс на факторы противовирусного иммунитета in vitro

О.Ф. Мельников, М.Д. Тимченко, Л.Д. Кривохатская, Э.А. Мурзина
ГУ «Институт отоларингологии им. проф. А.И. Коломийченко АМН Украины»

Резюме. В условиях эксперимента in vitro изучено влияние препарата Септолете плюс на выработку α- и γ-интерферонов клетками небных миндалин и мононуклеаров периферической крови больных хроническим тонзиллитом в присутствии индуктора интерферона и без него, а также на цитолитическую активность в отношении ксеногенных эритроцитов. Установлено, что препарат Септолете плюс активировал продукцию раннего интерферона и выступал в роли кофактора при использовании индуктора интерфероногенеза — ридостина. Препарат умеренно стимулировал цитолитическую активность естественных цитотоксических клеток миндалин и периферической крови.
Ключевые слова: Септолете плюс, интерферон, противовирусный иммунитет.

Введение

Сегодня в связи с повышением уровня заболеваний, обусловленных вирусами, и особенно гриппа, наблюдается увеличение числа исследований, направленных на изучение антивирусных свойств у фармацевтических препаратов, которые используются как противовоспалительные средства [2, 6]. Одним из эффективных препаратов с антисептическим характером действия, который широко используется в отоларингологии, является препарат местного применения — Септолете плюс, состоящий из цетилпиридиния хлорид (антисептический компонент) и анестетика (бензокаин). Ранее было показано, что Септолете плюс не обладает депрессорным действием на состояние местного иммунитета, основанного на определении иммуноглобулинов, лактоферрина и цитокинов в ротоглоточном секрете больных острым фарингитом [8]. Известно, что одним из основных антивирусных механизмов является продукция ранних интерферонов — α- и β- и более позднего γ-интерферона [5]. Эти интерфероны на первых этапах вирусного заражения могут блокировать вирусную информационную РНК в инфицированной клетке и препятствовать репродукции вирусов. Далее интерфероны способны активировать естественные цитотоксические клетки (ЕЦК) и цитотоксические Т-лимфоциты [4]. По мнению авторов, механизм антивирусной защиты состоит, по крайней мере, из таких последовательных механизмов:

• внутриклеточная ингибиция ранними интерферонами репродукции вирусов;
• удаление с помощью ЕЦК и Т-лимфоцитов инфицированных клеток;
• приобретение здоровыми клетками, которые находятся возле очага заражения, резистентности к инфицированию за счет ранних интерферонов;
• привлечение в очаг заражения макрофагов и лейкоцитов и активация их функциональной активности.

Цель работы — исследовать in vitro антивирусные свойства препарата Септолете плюс, его способность усиливать продукцию интерферонов и деструктивные свойства тканевых и кровяных естественных цитотоксических клеток.

Материал и методы исследования

Исследования in vitro проведены на клетках небных миндалин и периферической крови 12 больных хроническим тонзиллитом в возрасте 7–19 лет. Этим больным по показаниям проведена тонзилэктомия. Клеточный материал получен из ткани миндалин и крови в соответствии с рекомендациями О.Ф. Мельникова и И.П. Кайдашева [7, 10]. Культивирование клеток проводили в питательной среде RPMI-1640 с добавками (L-глютамин, эмбриональная телячья сыворотка 5%, гентамицин 40 мкг/мл) в течение 18 часов для определения уровня цитолиза и в течение 24 часов — для определения интерферонопродукции с различными концентрациями препарата: «1» и «2». Контролем служили образцы культивируемых клеток крови и миндалин без препарата, где определяли исходный уровень активности и через 24 часа культивирования. Разведение препарата Септолете плюс «1» соответствовало добавлению к клеткам 0,1 мл водно-солевого экстракта, содержащего 1 измельченную таблетку препарата в 5 мл раствора Хэнкса и стерилизованного пропусканием через фильтр типа Millipore. Разведение «2» соответствовало 0,01 мл исходной концентрации. После 18-часового культивирования в опытных и контрольных образцах определяли цитолитическую активность клеток в отношении эритроцитов цыплят по спектрофотометрическому методу (анализатор Stat-fax 2100, США), описанному О.Ф. Мельниковым и Т.А. Заяц [11]. В надосадочной жидкости после суточного культивирования клеток определяли содержание α- и γ-интерферонов иммуноферментным методом с помощью набора реактивов ООО «Протеиновый контур» (Спб, РФ) и иммуноферментного анализатора Stat-Fax-2100 (США). Кроме того, для проверки предположения о возможной потенцирующей интерферонообразование способности препарата в отдельные пробы с указанными концентрациями препарата добавляли индуктор интерфероногенеза – ридостин по 0,1 мл. Все пробы выполнялись в дублирующем исполнении. Материалы статистически обработаны с применением метода углового преобразования (?) по Фишеру [1].

Результаты исследований и их обсуждение

В ходе исследования установлено, что препарат Септолете плюс достоверно усиливал образование ранних (α) интерферонов в культуре как клеток миндалин, так и клеток крови и обладал потенцирующим действием при добавлении ридостина (табл. 1). На продукцию позднего, иммунного интерферона (γ) как клетками небных миндалин, так и клетками крови препарат влияния не оказывал (рис. 1).

Это обстоятельство определяет исключительную целесообразность применения Септолете плюс на ранних этапах инфекционного вирусного процесса, т.к. в процессе его рассасывания в ротовой полости препарат контактирует с поверхностью небных миндалин или диффузными лимфоидными фолликулами и может активировать в них продукцию α-интерферона.

Что касается влияния препарата на цитолитическую активность клеток крови и небных миндалин, то достоверного усиления этой активности выявлено не было (табл. 2). Хотя вектор отклонений при добавлении различных концентраций препарата был одинаковым в сторону усиления деструктивной способности клеток (30–89% от исходной величины) при использовании Септолете плюс в 9 из 12 наблюдений.

Таблица 1
Продукция α-интерферона клетками небных миндалин и крови in vitro под действием Септолете плюс

Группа	Концентрация α-интерферона, пг/мл
	клетки небных миндалин, М±m	клетки периферической крови, M±m
Исходный уровень	8,4±0,9	8,2±1,5
Септолете плюс	15,3±1,8* (<0,01)	17,0±2,9* (<0,05)
Септолете плюс + ридостин	22,1±3,3 (<0,07)	25,0±4,3* (>0,05)

Примечание. * — в сравнении с препаратом.

Таблица 2
Цитолитическая активность клеток небных миндалин и крови больных хроническим тонзиллитом при культивировании с различными концентрациями препарата Септолете плюс

Группа	Активность деструкции мишеней - % эритроцитолиза
	клетки небных миндалин, М±m	клетки периферической крови, M±m
Исходная взвесь клеток	20,1±6,0	28,6±10,1
+ Септолете «1»	24,7±4,5	34,6±10,3
+ Септолете «2»	26,0±7,3	36,0±11,3

Рис. Влияние препарата Септолете плюс в различных концентрациях на продукцию γ-интерферона клетками небных миндалин и периферической крови in vitro

Известно, что активация функции ЕЦК связана с влиянием системы интерферона и других цитокинов [13] и до известной степени определяет противовирусный потенциал препарата [3, 4, 9]. Исходя из того, что препарат способен активировать синтез ранних интерферонов, играющих важную роль на начальных этапах инфекционного процесса [12], можно считать целесообразным применение препарата Септолете плюс в начальных стадиях вирусной инфекции.

Выводы

1. Раствор препарата Септолете плюс в условиях культивирования с клетками небных миндалин или периферической крови активирует синтез α-интерферона.
2. Препарат Септолете плюс способен усиливать действие индуктора α-интерферона — ридостина в условиях in vitro.
3. Не выявлено существенных изменений в продукции позднего интерферона (γ) в культуре клеток крови и миндалин под действием препарата Септоле-те плюс.
4. Препарат Септолете плюс не угнетал активности естественных цитотоксических клеток крови и миндалин in vitro и имел вектор изменений в сторону стимуляции деструктивной активности мононуклеаров.
5. Препарат Септолете плюс может применяться при массовых вирусных заболеваниях верхних дыхательных путей.

Литература

1. Гублер Е. В. Математические методы анализа и распознавания патологических процессов / Е. В. Гублер. - Л. : Медицина, 1978. - 294 с.
2. Действие препарата Инфлюцид in vitro против пандемического штамма 2009 г А (Н1N1) «Свиного» («мексиканского») гриппа / М. Ю. Еропкин, Н. И. Коновалов, В. А. Григорьева [и др.] // Традиционная медицина. - 2009. -№3(18). - С. 8-12.
3. Дранник Г. Н. Клиническая иммунология и аллергология / Г. Н. Дранник. -К. : Полиграф-Плюс, 2006. - 481 с.
4. Ершов Ф. И. Ранние цитокиновые реакции при вирусных инфекциях / Ф. И. Ершов, А. Н. Норовлянский, М. В. Мезенцева // Цитокины и воспаление. - 2004. - Т. 3, №1. - С. 3-6.
5. Ершов Ф. И. Система интерферонов в норме и патологии / Ф. И. Ершов. -М. : Медицина,1996. - 240 с.
6. Исследование противовоспалительных свойств тонзилотрена в эксперименте / О. Ф. Мельников, С. В. Тимченко, И. В. Фараон, А. Ю. Бредун // Журн. вушн., нос. і горлових хвороб. - 2008. - №6. - С. 37-40.
7. Кайдашев І. П. Методи клінічних та експериментальних досліджень у медицин / І. П. Кайдашев. - Полтава : Полимет, 2003. - 319с.
8. Клинико-иммунологическая характеристика больных хроническим фарингитом в стадии обострения при лечении препаратом Септолете плюс / Д. И. Заболотный, В. Д. Пшеничкина, О. Г. Вольская, О. Ф. Мельников // Журн. вушн., нос. і горлових хвороб. — 2007. — №6. — С. 2—8.
9. Кривицкая В. З. Иммунопатологический аллергический Th-2 тип противовирусного гуморального иммунитета у детей с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией / В. З. Кривицкая, А. А. Сомнина, В. Ф. Сухолвецкая // Цитокины и воспаление. — 2004. — Т. 3, №3. — С. 34—37.
10. Мельников О. Ф. Иммунологические аспекты генеза хронического тонзиллита и регуляции функциональной активности небных миндалин : дис. … д-ра мед. наук : 14.00.16 / О. Ф. Мельников ; Институт физиологии АН УССР. — К., 1981. — 294 с.
11. Мельников О. Ф. Сравнительная оценка радиоизотопного и спектрофото-метрического методов регистрации цитолиза / О. Ф. Мельников, Т. А. Заяц // Лаб. диагностика. — 1999. — №2. — С. 32—34.
12. Никулин Б. А. Оценка и коррекция иммунного статуса / Б. А. Никулин. — М. : ГЭОТА, 2008. — 375 с.
13. Симбирцев А. С. Цитокины : классификация и биологические функции / А. С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. — 2004. — Т. 3, №2. — С. 16—22.