Обзор механизмов аллергии
Эбастин обладает не только антигистаминным эффектом

Alison Campbell,¹ François-Bernard Michel,¹ Clotilde Bremard-Oury,² Louis Crampette³ и Jean Bousquet¹
 1. Service des Maladies Respiratoires&INSERM U454 Hôpital Arnaud de Villeneuve, Монпелье, Франция
 2. Rhône-Poulenc Rorer, SPECIA, Париж, Франция
 3. Service d’ORL, Hôpital Saint Charles, Монпелье, Франция

Резюме

Антагонисты гистамина, также как и стероиды для местного применения, являются препаратами выбора при аллергическом рините. Многие из этих антагонистов гистамина проявляют дополнительные эффекты, кроме блокады гистаминового рецептора. В этом исследовании мы изучали влияние эбастина и каребастина на выделение эйкозаноидов и цитокинов из изолированных человеческих клеток назальных полипов и влияние данных веществ на высвобождение медиаторов воспаления в жидкость, полученную в результате назального лаважа, после провокационной пробы с аллергеном. Было показано, что эбастин блокирует индуцированное антителами к иммуноглобулину Е высвобождение простагландина D₂ (PgD₂) и лейкотриенов C₄/D₄ из клеток носового полипа человека (значения 30% ингибирующей концентрации (IC₃₀) 2,57 и 9,6 мкмоль/л соответственно) и ингибирует высвобождение цитокинов. Каребастин ингибировал высвобождение простагландина D₂ (PgD₂) (значения 30% ингибирующей концентрации (IC₃₀) 8,14 мкмоль/л), но оказывал слабое воздействие на высвобождение цитокинов. При проведении пациентам назальной провокационной пробы с аллергеном, эбастин значительно повышал среднее количество пыльцевых зерен, необходимых для того, чтобы вызвать аллергическую реакцию. Кроме того, лекарственный препарат ингибировал высвобождение колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов, но не оказывал никакого действия на все остальные медиаторы, определение концентрации которых проводилось.

Антагонисты Н₁ гистаминового рецептора, также как и стероиды для местного применения, остаются препаратами выбора при аллергическом рините. Не считая сильного антигистаминного эффекта, механизм действия антагонистов Н₁ гистаминового рецептора требуют дальнейшего изучения, поскольку они обладают свойствами, которые не связаны с блокировкой гистамина на уровне его рецептора. [1]

Для оценки противоаллергических свойств антагонистов Н₁ гистаминового рецептора могут быть использованы тесты как in vitro так и in vivo. Клетки, изолированные из носовых полипов, представляют интересную модель для изучения фармакологии противоаллергических и противоастматических лекарственных препаратов, поскольку они происходят из воспаленной ткани и являются сенсибилизированными, подобно клетками при воспалении, обусловленном ринитом. [2-5]

Носовые полипы, которые могут быть различной этиологии, характеризируются наличием гиперплазированной отекшей слизистой оболочки, и произрастают из этмоидальных пазух. [6] Из клеток носового полипа высвобождаются многочисленные разнообразные медиаторы, принимающие участие в аллергической реакции, среди которых эйкозаноиды, гистамин и цитокины. После пассивной сенсибилизации клетки носового полипа могут быть активированы зависимым от антител к иммуноглобулину Е механизмом для высвобождения многих из этих медиаторов.

Мы провели исследование с использованием изолированных клеток, полученных из удаленных хирургическим путем носовых полипов, с целью изучения влияния эбастина и каребастина in vitro на высвобождение эйкозаноидов [лейкотриенов C₄/D₄ (LTC₄/D₄) и простагландина D₂(PGD₂)] после стимуляции антителами к иммуноглобулину Е и спонтанное высвобождение цитокинов [колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), фактора некроза опухолей-α (TNF-α) и интерлейкина-8 (IL-8)].

Назальная провокационная проба с аллергенами широко применялась для изучения противоаллергической активности антагонистов Н₁ гистаминового рецептора in vivo. Лаваж слизистой носа после воздействия аллергенов дает возможность получить и измерить концентрацию воспалительных медиаторов и цитокинов, [1,7,8] высвобождение которых может быть блокировано антагонистами Н₁ гистаминового рецептора. С целью измерения влияния эбастина на высвобождение медиаторов аллергии in vivo, мы сравнивали действие эбастина в дозировке 10 мг и 20 мг один раз в сутки на высвобождение медиаторов воспаления, с действием плацебо, в двойном слепом перекрестном исследовании с участием 12 пациентов с сезонным аллергическим ринитом.

1. Материалы и методы

1.1 Исследование носового полипа in vitro

Клетки носового полипа были получены от 10 пациентов (6 мужчин, 4 женщины в возрасте от 18 до 61 года) с полипозом носа. Клетки были изолированы согласно методике, раннее применявшейся для получения клеток паренхимы легких, поскольку было обнаружено, что клетки, полученные путем ферментации, могут быть использованы для фармакологических исследований. [9]

Полип сперва рассекался ножницами на кусочки размером приблизительно 1 мм³, а разъединение клеток проводилось путем ферментативного расщепления модифицированным методом Holgate и др.[10.11] Рассеченная ткань полипа в течение двух часов находилась в четырех объемах среды для культивирования RPMI (среда Института имени Розуэелла Парка) линии 1640 (фирма «Гибко» (Gibco), Пейсли, Шотландия), которая содержит гиалуронидазу в концентрации 0,75 г/л, коллагеназу в концентрации 1,5 г/л и протеазу типа XIV в концентрации 2 г/л (все получено из компании «Сигма» (Sigma Co.), Сент-Луис, Миссури). Изоляция клеток проводилась при 37°С в качающейся водяной бане. В конце периода ферментативного расщепления клетки последовательно отфильтровывались, с целью отделения от нерасщепленной ткани. Затем они повторно растворялись в среде RPMI и троекратно отмывались для удаления ферментов. Клетки были сенсибилизированы путем инкубации с 10% атопической сывороткой при 37°С в течение 1 часа, а затем снова трижды отмыты.

Жизнеспособность клеток оценивалась до стимуляции и в конце периода инкубации путем измерения вытеснения красителя трипанового синего. Клетки описывались на стеклах, приготовленных путем центрифугирования, и окрашиванных по Май Грюнвальду – Гимзе (May Grunwald Giemsa).

С целью измерения влияния эбастина и его метаболита каребастина на высвобождение медиаторов воспаления, подготовленные клетки носового полипа были повторно растворены в среде RPMI с концентрацией 1*10⁶ клеток/мл и в течение 20 минут преинкубированы с эбастином или каребастином (в концентрации 0,1, 1, и 10 мкмоль/л) или с растворителем, который использовался для растворения веществ [диметилсульфоксид (DMSO) в конечной концентрации 0,1%]. Затем, с целью измерения эйкозаноидов, они подвергались воздействию специфических ε-цепей антител к иммуноглобулину Е [компания «Иммунотех» (Immunotech), Люмини, Франция] в концентрации 10 мг/л в течение 45 минут при 37°С. Для измерения цитокинов клетки инкубировались в течение 24 часов без каких-либо стимуляторов секреции.

Для измерения высвобождения медиаторов лейкотриенов C₄/D₄ (LTC₄/D₄) и простагландина D₂(PGD₂) использовался имеющийся в продаже набор для иммуноферментного анализа (EIA) (Stallergenes, Френ, Франция), а цитокины (колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), фактор некроза опухолей-α (TNF-α) и интерлейкин-8 (IL-8)) измерялись твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) (компания «Гензим» (Genzyme), Кембридж, Массачусетс, США).

1.2 Исследование активности эбастина in vivo.

Исследование носовой провокационной пробы было проведено с участием 12 пациентов в возрасте от 20 до 38 лет после получения их информированного согласия. Исследование было разрешено Этическим комитетом университета Монпелье (Montpellier University). У пациентов наблюдались симптомы сезонного аллергического ринита и положительные кожные пробы с 1/100 (вес/объем) стандартизированного экстракта пыльцы ежи сборной (Dactylis glomerata) (компания «Лаборатории Сталлергенес» (Laboratories des Stallergenes), Френ, Франция). У всех пациентов наблюдалось повышение титров иммуноглобулина Е к пыльце ежи сборной в плазме крови (радиоаллергосорбентный тест «Фадебаст» (Phadebast RAST); компания «Фармация Диагностикс» (Pharmacia Diagnostics), Упсала, Швеция). Никто из пациентов не получал лечения антигистаминными препаратами, кортикостероидами или кетотифеном в течение 2 недель до начала исследования, а также астемизолом или имипрамином в течение предыдущего месяца.

Назальная провокационная проба проводилась в то время, когда никакой специфической пыльцы в атмосфере не обнаруживалось. Капсулы, содержащие лактозу или зерна пыльцы ежи сборной в количестве, увеличивающемся от 50 до 156250 зерен (5*5-кратное увеличение) [Laboratoires des Stallergènes, Френ, Франция], инсуфлировались в ноздри носовым аэрозолем «Spinhaler» (компания «Лаборатории Фисонс» (Fisons Laboratories), Лафборо, Англия); пациенты задерживали дыхание при инсуфляции. Для каждого количества пыльцы носовой аэрозоль «Spinhaler» применяли 5 раз. Каждая капсула раскрывалась после инсуфляции, с целью убедиться, что она полностью пуста.

Сначала инсуфлировалась лактоза, и последующие симптомы регистрировались в течение 15 минут. Затем каждые 15 минут в ноздри инсуфлировались зерна пыльцы в порядке увеличения количества до тех пор, пока по шкале симптомов не получали 5 баллов: 5 последовательных чиханий (3 балла), ринорея (от 1 до 3 баллов), заложенность носа (от 1 до 3 баллов) или зуд в носу (1 балл). Назальная провокационная проба проводилась путем инсуфляции зерен пыльцы ежи сборной в количестве, увеличивающемся от 50 до 781250 (6*5 кратное увеличение) до тех пор, пока суммарный балл по шкале симптомов не достигнет исходного уровня. [12]

Выделения из носа получали путем назального лаважа до реакции и в течение ранней и поздней фаз реакции. До каждой провокационной пробы проводился лаваж каждой ноздри 5 мл физиологического раствора троекратно с целью уменьшения уровня медиаторов. Назальный лаваж также проводился через 15 минут после вдувания лактозы или аллергена и повторялся через 6 часов после немедленной реакции (поздняя фаза реакции).

Выделения из носа хранились на льду до конца эксперимента. Затем они центрифугировались при +4°С в течении 15 минут при 15000 g. Твердая фаза отделялась от гелеобразной фазы пипеткой и хранилась при -20°С до момента проведения анализа.

Для измерения высвобождения медиаторов лейкотриенов C₄/D₄ (LTC₄/D₄) и простагландина D₂(PGD₂) использовался имеющийся в продаже набор для иммуноферментного анализа (EIA) (Stallergenes, Френ, Франция), а цитокины (колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), фактор некроза опухолей-α (TNF-α) и интерлейкин-8 (IL-8)) измерялись твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) (компания «Гензим» (Genzyme), Кембридж, Массачусетс, США).

Первая назальная провокационная проба проводилась до какого-либо лечения для определения исходной реактивности пациентов по отношению к аллергенам. С целью измерения влияния эбастина на аллергическую реакцию, пациенты получали лечение плацебо или эбастин в дозировке 10 мг или 20 мг один раз в сутки в течение 7 дней, согласно плану перекрестного исследования. Интервал между последним приемом лекарственного препарата и аллергической пробой составлял 1 час. Назальные провокационные пробы проводились в конце каждого периода лечения с 7–дневным периодом «отмывки» между периодами лечения.

2. Результаты

2.1 Исследование носового полипа in vitro

Популяция клеток полученных из носовых полипов включала эпителиальные клетки, мононуклеарные клетки, эозинофилы и нейтрофилы. Однако наблюдалась высокая степень гетерогенности полипов по клеточному составу. Ни эбастин, ни каребастин не оказывали никакого влияния на жизнеспособность клеток, определенную по захвату красителя трипанового синего.

Антитела к иммуноглобулину Е вызывали значительное усиление высвобождения LTC₄/D₄ и PgD₂ из клеток носового полипа in vitro: спонтанное высвобождение (среднее ± стандартное отклонение (SD)) по сравнению с индуцированным антителами к иммуноглобулину Е высвобождением было 0,11±0,11 против 1,46±2,2 нг/10⁶ клеток для PgD₂ и 0,13±0,04 против 2,16±0,92 нг/106 клеток для LTC₄/D₄.

Эбастин в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкмоль/л значительно ингибировал это высвобождение PgD₂ и LTC₄/D с дозозависимым эффектом (таблица 1). Концентрации эбастина, необходимые для ингибирования высвобождения этих двух медиаторов на 30% (IC₃₀) были рассчитаны как 2,57 и 9,6 мкмоль/л соответственно. Каребастин также проявил способность ингибировать высвобождение PgD₂ из клеток носового полипа, но был менее активным, чем эбастин: значение 30% ингибирующей концентрации (IC₃₀) - 8,14 мкмоль/л. Эбастин и каребастин также ингибировали высвобождение цитокинов, хотя каребастин оказывал, в целом, меньшее влияние на эти медиаторы (таблица 1).

Таблица 1. Влияние эбастина и каребастина на высвобождение медиаторов из изолированных человеческих клеток носового полипа.

	Максимальное высвобождение нг/миллион клеток	Средний процент ингибирования
		эбастин (мкмоль/л)			каребастин (мкмоль/л)
		0,1	1	10	0,1	1	10
PgD2	1,46±2,2	16*	34**	50**	11*	14**	31**
LTC4/D4	2,16±0,92	12	20**	33**	5	6*	12*
TNFα	448±390	15	10	40**	11	15	25
GM-CSF	11±67	4	1	35*	6	3	8
IL-8	1046±363	0	12	52*	0	8	21

Аббревиатуры и символы: GM-CSF = колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов, IL-8 = интерлейкин-8, LTC₄/D₄ = лейкотриен C₄/D₄, PgD₂ = простагландина D₂ , TNFα = фактор некроза опухолей-α . * р<0,05, **р<0,005

2.2 Исследование активности эбастина in vivo.

Среднее количество зерен пыльцы, необходимое для индукции аллергической реакции, было достоверно ниже у принимавших плацебо, по сравнению с теми, кто принимал эбастин в дозировке 10 и 20 мг (рисунок 1). Эбастин в дозировке 20 мг вызывал достоверное повышение среднего порогового количества зерен пыльцы, необходимого для индукции положительного ответа, по сравнению с плацебо (р<0,003) и эбастином в дозировке 10 мг (р<0,02).

Эбастин уменьшал высвобождение колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) с дозозависимым эффектом (рисунок 2). Высвобождение лейкотриена LTC₄/D₄ и PgD₂, обнаруженное у большинства пациентов при назальной провокационной пробе, достоверно не нарушалось под влиянием эбастина. Кроме того, эбастин не влиял на высвобождение цитокинов.

Клинически поздняя фаза реакции (заложенность носа, в итоге сопровождавшаяся ринореей) наблюдалась у крайне небольшого количества пациентов, недостаточного для исследования.

Рисунок 1. Среднее пороговое количество зерен пыльцы, необходимое для индукции аллергического ответа у 12 пациентов, получавших лечение плацебо или эбастином (Е) в дозировке 10 мг или 20 мг один раз в сутки в течение 7 дней.

Примечания переводчика: Placebo- плацебо, mg – мг.

Рисунок 2. Высвобождение колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) через 6 часов после назальной провокационной пробы с аллергеном у 12 пациентов, получавших лечение плацебо или эбастином (Е) в дозировке 10 мг или 20 мг один раз в сутки в течение 7 дней.

3. Обсуждение.

Как было уже показано ранее с применением назальной провокационной пробы с аллергеном, азатидин, лоратидин и терфенадин ингибируют высвобождение гистамина, PgD₂ и кининов. [1,13-15] Кроме того, азеластин и цетиризин ингибируют высвобождение лейкотриенов. [15,16] Мы показали, что эбастин блокирует высвобождение индуцированных антителами к иммуноглобулину Е простагландина D₂ (PgD₂) и лейкотриенов C₄/D₄ (LTC₄/D₄) из человеческих клеток носового полипа in vitro и ингибирует высвобождение цитокинов. Ни в каких других исследованиях не применялась данная модель с целью исследования влияния других антигистаминных препаратов на высвобождение медиаторов in vitro; таким образом, не представляется возможным сравнить эти препараты с эбастином. Механизмы, с помощью которых антигистаминные препараты нарушают высвобождение медиатора, остаются неописанными.

4. Заключение.

Таким образом, эбастин, антагонист Н₁ гистаминового рецептора, имеет способность ингибировать высвобождение лейкотриена C₄/D₄ (LTC₄/D₄), простагландина D₂ (PgD₂) и цитокинов из клеток полипа носа in vitro. Каребастин угнетает высвобождение простагландина D2 (PgD2), но в целом имеет меньшее, чем эбастин, влияние на этот и другие медиаторы. У пациентов с сезонным аллергическим ринитом эбастин в дозировке 10 и 20 мг один раз в сутки в течение 7 дней достоверно повышал количество зерен пыльцы, необходимых для индукции аллергического ответа, по сравнению с плацебо, а также уменьшал высвобождение колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF).

Ссылки на литературу.

Корреспонденция и репринты: Service des Maladies Respiratoires, Hôpital Arnaud de Villeneuve