Гематология

Вестник Санкт-Петербургской медицинской академии им. И. И. Мечникова. 2003. № 4. С 132–136.

Влияние реамберина на сосудисто-тромбоцитарное и плазменно-коагуляционное звенья гемостаза в плазме крови у доноров in vitro

А. А. Скоромец, В. В. Никитина, Б. А. Барышев
Кафедра неврологии и нейрохирургии СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова, СанктПетербург

Введение

Реамберин — 1,5% — 400 мл — раствор для инфузий, выпускаемый НТФФ «Полисан», представляет собой изотоническую композицию соли янтарной кислоты (сукцинат натрия с хлоридами магния, калия и натрия), обладающую дезинтоксикационным, антиоксидантным эффектами при парентеральном введении. Присутствие в составе препарата ионов сукцината и магния создает предпосылки для реализации физико-химических влияний на белок-белковые взаимодействия и сродство различных лигандов плазмы крови к транспортным молекулам. В силу этого некоторые важные в практическом отношении эффекты препарата следует ожидать сразу после попадания его компонентов в кровь.

Цель исследования

Целью исследования являлось подтвердить наличие антиагрегантного действия препарата реамберин в крови in vitro у доноров. При выявлении обозначенного эффекта у препарата для выяснения механизмов развития антиагрегантного эффекта проводился анализ сосудисто-тромбоцитарного и плазменно-коагуляционного звеньев гемостаза в крови у доноров in vitro.

Методики исследования

Кровь для исследования забиралась у 22 доноров утром натощак пункционной иглой из локтевой вены самотеком. Свертываемость крови предупреждалась 3,8% раствором цитрата натрия, добавляемого в соотношении 1 : 9. Для исключения контактной активации тромбоцитов в работе использовалась пластмассовая или силиконовая посуда. Вначале кровь центрифугировали на малых оборотах (15 минут при 100 g). При этом определялась богатая тромбоцитами плазма, которая отсасывалась в пластмассовые пробирки. Затем оставшуюся кровь снова центрифугировали, но уже на более высоких оборотах (15 минут при 2000 g). Образовавшийся после повторного центрифугирования верхний слой являлся бестромбоцитарной плазмой. Плазма, богатая тромбоцитами, использовалась для исследования функциональной активности тромбоцитов, бестромбоцитарная плазма — для калибровки шкалы оптической плотности прибора и, при необходимости, для разведения богатой тромбоцитами плазмы до стандартного содержания клеток, которое должно составлять (200–250) × 10⁹/л.

Для исследования влияния реамберина на показатели свертывающей системы крови in vitro в 0,874 мл плазмы крови 22 доноров — основная серия опытов — добавлялось 0,026 мл раствора препарата или 0,026 мл физиологического раствора — контрольная серия опытов. Эти растворы инкубировались в течение 10 и 60 минут при температуре 37° C. После этого производился анализ показателей тромбоцитарного и плазменнокоагуляционного звеньев гемостаза. Исследование проводили с использованием агрегометра АР 2110 (Беларусь, Минск). Анализировались следующие показатели: число тромбоцитов, 10⁹/л (в контрольной группе 222,9±6,18), время достижения максимальной агрегации тромбоцитов, сек (в контрольной группе 7,14±0,78), максимальная амплитуда (в контрольной группе 14,3±1,8), скорость на 30 сек., %/мин (в контрольной группе 10,12±0,98).

Диагностический комплекс агрегирующих агентов использовался для преимущественного выявления того или иного звена в цепи реакций, лежащих в основе агрегационного процесса: состояния соответствующих мембранных рецепторов (АДФ, адреналин), способности кровяных пластинок развивать реакции освобождения (АДФ, адреналин, коллаген). Исследование индукционной агрегации тромбоцитов проводилось на агрегометре АР 2110 с различными агрегирующими агентами: АДФ 5 мкМ («Технология-стандарт», Россия), адреналином 5 мкМ («Технология-стандарт», Россия), коллагеном 0,2 мг/л, адгезии — коллагеном 2 мг/л (СПбНИИ ГТ, Россия). Исследование по определению активированного времени рекальцификации (АВР) (каолиновое время) проводилось с помощью метода Bergerhof U.и [1954], протромбинового времени. Протромбиновый индекс (ПТИ), проводилось одностадийно по A. Quick [1966], фибриногена с помощью метода Рутберга Р. А. [1961]. Тромбинового времени с помощью метода R. Marbet, Winterstein. [1959] (Детинкина Г. Н. и соавт., 1984). Индекс коагуляции (ИК) АВР вычислялся с помощью формулы:

ИКАВР=АВРД/АВРП,

где Д — донор, П — пациент.

Протромбиновый индекс (ПТИ) вычислялся по формуле:

ПТИ (%) = ПВД/ПВП × 100%,

где ПВ — протромбиновое время.

Для качественного определения в плазме крови растворимых фибринмономерных комплексов (РФМК) применялся РФМК-тест (Момот А. П. и соавт., 1996), активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) определяли согласно инструкции «Технологии-стандарт» (Россия). С помощью этого исследования определялось время свертывания крови в условиях стандартизованной контактной (каолином) и фосфолипидной (кефалином) активации процесса в присутствии ионов кальция.

Индекс АПТВ вычислялся с помощью формулы:

Индекс АПТВ = АПТВП/АПТВД

Активность антитромбина III (АТ III) определяли согласно инструкции «Технологии-стандарт» (Россия).

Протромбиновое отношение (ПО) вычисляли по формуле:

ПО = (Протромбиновое время больного) / (Протромбиновое время плазмы)

В последующем рассчитывали международное нормализованное отношение (МНО), исходя из ПО и международного индекса чувствительности (МИЧ) (Гаранина Е.Н и соавт., 1994). D-димер в плазме крови исследовался качественно (Тиц Н., 1997).

Результаты исследования

Сосудисто-тромбоцитарное звено гемостаза
Необходимо обратить внимание на то, что гиперагрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ, позволяет судить о повышении первичной агрегации кровяных пластинок, которая является обратимой (Репина М. А. и соавт., 1998).
В механизме агрегации тромбоцитов исключительно важную роль играют циклические эндоперекиси и тромбоксаны. Под влиянием индукторов агрегации коллагена и тромбина активируется фосфолипаза А2 мембраны тромбоцитов, что обеспечивает активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ), приводя к расщеплению фосфолипидов мембраны (Амелин А. В. с соавт., 2000). Интересен тот факт, что в плазме крови доноров, в которую добавляли реамберин, отмечалось достоверное увеличение времени достижения максимальной амплитуды агрегатограммы как после инкубации 10 минут, так и после инкубации 60 минут, что свидетельствует о возможном снижении скорости склеивания тромбоцитов между собой (Багатырова К. М., 1993).
Последнее обстоятельство носит позитивный характер и может расцениваться как прогностически благоприятный критерий для рекомендаций по применению препарата у пациентов с тромботическими поражениями артерий организма. Этот параметр в плазме крови доноров контрольной группы после добавления физиологического раствора при инкубации 10 и 60 минут практически не отличался от его значения в плазме крови доноров без добавления физиологического раствора.

Плазменно-коагуляционное звено гемостаза
Условно процесс активации свертывания крови подразделяют на три стадии: образование протромбиназы, образование тромбина и образование нерастворимого фибрина.

Активация фактора Х по внутреннему пути. В плазме крови доноров под влиянием реамберина регистрировалось снижение индекса АВР без тромбоцитов, АВР с тромбоцитами и укорочение АПТВ по сравнению с этими показателями в плазме крови доноров в контрольной серии опытов. Изменения в этих группах не выходили за рамки нормы.

Активация фактора Х по внешнему пути. В плазме крови доноров с реамберином выявлено удлинение протромбинового времени по сравнению с этими показателями в плазме крови доноров в контрольной серии опытов. Изменения в этих группах не выходили за рамки нормы.

Образование фибрина. При проведении исследования было зарегистрировано достоверное увеличение тромбинового времени в плазме крови доноров после добавления реамберина по сравнению с этими показателями в плазме крови доноров в контрольной серии опытов.
Отмечено достоверное уменьшение концентрации фибриногена в плазме крови после использования реамберина по сравнению с уровнем этого показателя в плазме крови контрольной серии опытов. Изменения в этих группах не выходили за рамки нормы. В свою очередь, необходимо отметить, что уровень РФМК в плазме крови у доноров под влиянием реамберина несколько ниже, чем в контроле. Изменения в этих группах выходили за рамки нормы.

Физиологические антикоагулянты. Активность одного из естественных антикоагулянтов — антитромбина III, снижалась под влиянием реамберина, по сравнению с контрольной группой.
При проведении статистической обработки остальных данных плазменно-коагуляционного звена гемостаза с использованием критерия Стьюдента отклонений от показателей нормы в основной и в контрольной серии опытов не получено.

Обсуждение полученных результатов

Под влиянием реамберина в плазме крови доноров in vitro наблюдается тенденция ускорения активации фактора X по внутреннему пути и торможение активации фактора X по внешнему пути.

Достоверное удлинение тромбинового времени под влиянием реамберина в плазме крови доноров in vitro при нормальной концентрации антитромбина III, отсутствии D-димеров позволяет говорить о наличии ранних продуктов деградации фибриногена (X), обладающих антитромбиновой активностью.

Достоверное снижение концентрации фибриногена в сочетании с удлинением тромбинового времени под влиянием реамберина в плазме крови доноров in vitro, по-видимому, можно объяснить фибриногенолизом.

Заключение

Добавление раствора реамберина в плазму крови доноров in vitro приводит к:

1. антиагрегантному эффекту;
2. фибриногенолизу.

Далее: