Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
14.03.06. - фармакология, клиническая фармакология
14.01.10. – кожные и венерические болезни
Москва – 2011

КЛИНИКО - ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ЦИТОХРОМА Р450 3А4 У БОЛЬНЫХ ОНИХОМИКОЗОМ

СИЗОВА ОКСАНА СЕРГЕЕВНА

Работа выполнена в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России и в ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России
Научные руководители:
Доктор медицинских наук, профессор ШИХ Евгения Валерьевна
Доктор медицинских наук, профессор ПОТЕКАЕВ Николай Николаевич
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор ЧЕЛЬЦОВ Виктор Владимирович
Доктор медицинских наук, профессор ЛЬВОВ Андрей Николаевич
Ведущая организация: ГОУ ДПО Российская медицинская академия постдипломного образования Росздрава
Защита диссертации состоялась 15 марта 2011 года на заседании Диссертационного совета Д.208.040.13 при ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России (119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр.2)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России (117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49)

---

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы
Поражение кожи и ее придатков грибковой инфекцией остается одной из наиболее важных проблем дерматологии (Потекаев Н.С., 2006; Sigurgeirsson B, 2002). По данным мировой литературы, в общей популяции грибковыми инфекциями страдает каждый 4-й житель планеты (Gupta A.K., Scher R.K. 2008). На территории Российской Федерации инфицированность патогенными грибами составляет в среднем 30–40% (Сергеев Ю.В., 2000).

Наиболее часто встречающейся формой грибковых инфекций является онихомикоз (Новоселов В.С., 2004, Сергеев А.Ю., 2006). По данным ВОЗ (2002), микозами стоп страдает от 11,5 до 18% населения. Это заболевание приводит к разрушению ногтевой пластинки, что, в свою очередь, ведет к появлению тревоги, пониженной самооценке, снижению работоспособности (Курдина М.И., Иваников И.О., Сюткин В.Е., 2004).

В связи с отсутствием субъективных ощущений при онихомикозах преобладает поздняя обращаемость к врачу, когда поражение ногтей становится распространенным, а наружное лечение малоэффективным.

Больным с множественными поражениями ногтей и кожи, а также при отсутствии эффекта от местной терапии показано лечение антимикотиками системного действия (Потекаев Н.С. 2005; Evans EG, 1999.; Sigurgeirsson B, 2002). В последние годы синтезированы новые поколения антимикотиков для системного применения, что привело к изменению подходов к рациональной фармакотерапии онихомикозов.

Одним из наиболее эффективных препаратов для лечения онихомикоза является противогрибковый препарат из класса азолов итраконазол, обладающий фунгицидным и фунгистатическим действием в отношении дерматофитов и дрожжевых грибов, однако в последние годы его применяют несколько реже, в связи с возможным гепатотоксическим действием.

Показано, что гепатотоксический эффект азолов, как правило, связан с повышением концентрации препарата в плазме крови (Wang J.L., Chang C.H., 2010.) Сопутствующее применение других ЛС может изменять биотрансформацию итраконазола, а через нее и концентрацию ЛС в плазме крови, что может иметь важное клиническое значение. Итраконазол является одновременно субстратом и ингибитором изофермента цитохрома Р450 3А4 (CYP3A4). В связи с этим изменение активности этого фермента может повлиять на эффективность и безопасность длительного применения итраконазола.

В настоящее время в фармакотерапии онихомикозов наряду с противогрибковыми препаратами часто применяют гепатопротекторы. Известным является факт различного влияния гепатопротекторов на активность цитохрома Р450 3А4, однако рекомендации по рациональному выбору препаратов этой группы в зависимости от влияния их на активность ферментов системы метаболизма отсутствуют.

В связи с этим, весьма актуальным является сравнительное изучение применения гепатопротекторов с различным влиянием на активность цитохрома Р450 3А4 в комбинации с препаратом итраконазол при лечении онихомикозов.

Цель исследования
Оптимизация фармакотерапии больных онихомикозом антимикотическими препаратами в сочетании с гепатопротекторами, оказывающих различное влияние на изофермент CYP 450 3A4, на основе клинико-экспериментального изучения и возможностей фармакологической регуляции активности гемопротеина.

Задачи исследования

Изучить в эксперименте с помощью электрохимического метода исследования влияние силибинина и таурина на активность изофермента цитохрома Р450 3А4, метаболизирующего итраконазол.

Изучить влияние силибинина и таурина на активность изофермента цитохрома Р450 3А4 с помощью теста определения соотношения 6.-гидроксикортизола/ кортизол в моче у больных онихомикозом на фоне длительного лечения итраконазолом.

Изучить динамику изменения максимальной равновесной концентрации итраконазола в плазме крови больных онихомикозом на фоне проводимой пульс-терапии.

Оценить клиническую эффективность различных комбинаций итраконазола и гепатопротекторов по динамике регрессии клинико- лабораторных симптомов онихомикоза и показателей, характеризующих функцию печени.

Сопоставить данные эксперимента (in vitro) с динамикой клинико-лабораторных симптомов и биохимических показателей крови, характеризующих функцию печени, на фоне длительного применения итраконазола у больных онихомикозом.

Научная новизна

Впервые в эксперименте in vitro с помощью электрохимического метода изучено влияние различных гепатопротекторов (таурина и силибинина) на активность изофермента цитохрома Р450 3А4, метаболизирующего итраконазол.

Впервые у больных онихомикозом, принимающих итраконазол, изучено влияние гепатопротекторов (таурин и силибинин) на активность изофермента цитохрома Р450 3А4 с помощью неинвазивного метода по тесту определения соотношения 6β-гидроксикортизола/ кортизола в моче.

Впервые проведено сопоставление экспериментальных результатов, полученных с помощью электрохимических методов исследования (in vitro) с клинико-лабораторными показателями у больных онихомикозом (тест определения соотношения 6.-гидроксикортизола/ кортизол в моче (in vivo), динамикой регрессии клинических симптомов онихомикоза, динамикой биохимических показателей крови, характеризующих функцию печени, на фоне курсового применения итраконазола).

Практическая значимость

В экспериментальной части исследования показано, что таурин не является субстратом изофермента цитохрома Р450 3А4. Таурин нивелирует ингибирующее влияние итраконазола на цитохром Р450 3А4 в электрохимическом эксперименте.

Результаты теста определения соотношения 6β-гидроксикортизола/ кортизола в моче показали, что одновременное с итраконазолом назначение таурина больным онихомикозом на фоне длительного лечения приводит к статистически значимо меньшему ингибированию фермента цитохрома Р450 3А4.

Показано, что выбор в качестве гепатопротектора таурина, оказывающего индуцирующее действие на изофермент цитохрома Р450 3А4, позволяет повысить безопасность длительного применения итраконазола у больных онихомикозом.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы используются в практике кожно-венерологического диспансера №15 Юго-Восточного округа г. Москвы, кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней лечебного факультета, кафедры кожных и венерических болезней факультета послевузовского профессионального образования врачей ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М.Сеченова, ГКБ № 23 им. «Медсантруд» г. Москвы.

Положения, выносимые на защиту
1. По данным электрохимического эксперимента таурин не является субстратом изофермента цитохрома Р450 3А4.
2. По данным электрохимического эксперимента и результатам определения соотношения 6β- гидроксикортизол /кортизол таурин снижает ингибирующий эффект итраконазола на цитохром Р450 3А4.
3. По данным электрохимического эксперимента и результатам определения соотношения 6β- гидроксикортизол /кортизол силибинин не влияет на активность цитохрома Р450 3А4.
4. Эффективность и длительность терапии онихомикоза итраконазолом не зависит от выбора гепатопротектора.
5. Применение таурина в качестве гепатопротектора при лечении больных онихомикозом повышает безопасность фармакотерапии итраконазолом.

Апробация работы

Апробация работы проведена 14 декабря 2010 года на совместном заседании секции №1 Ученого Совета ФГБУ «НЦ ЭСМП» Минздравсоцразвития России и кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней лечебного факультета и кафедры кожных и венерических болезней факультета послевузовского профессионального образования врачей ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста, включает 15 таблиц, 20 рисунков, 2 фотографии и состоит из введения, обзора литературы, собственных результатов исследования, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 56 отечественных и 146 зарубежных источника.

База проведения исследования

ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения и социального развития России на базе ГКБ №23 им. «Медсантруд» г. Москвы и кафедра кожных и венерических болезней факультета послевузовского профессионального образования врачей ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И. М. Сеченова на базе кожно-венерологического диспансера №15 Юго-Восточного округа г. Москвы

Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в т.ч. 3 публикации в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В исследование включались амбулаторные больные онихомикозом обоего пола, обратившиеся за медицинской помощью в микологический кабинет кожно-венерологического диспансера №15 Юго-Восточного округа г. Москвы.

Под наблюдением находились 104 больных онихомикозом в возрасте от 37 до 74 лет (средний возраст – 57,54 ±9,8 лет, мужчин – 60 (57,7 %), женщин - 44 (42,3 %)). Масса тела колебалась от 55 до 116 кг (средняя масса тела – 82,6±7,6 кг), рост от 157 см до 186 см (средний рост – 171,2±11,0 см). Анамнестическая длительность заболевания варьировала от 2 месяцев до 35 лет, в среднем - 65,3 ±15,8 мес. 44 (42,3%) больных имели достаточно короткий анамнез заболевания (от 2-х месяцев до 1 года), у 30 (28,8%) больных анамнестическая длительность микоза ногтей составила более 120 месяцев.

Клиническая характеристика больных, включенных в исследование, представлена в табл. № 1.

Согласно дизайну исследования все пациенты были разделены на 3 группы в зависимости от вида применяемой лекарственной терапии. 34 больных онихомикозом получали в качестве антимикотической терапии монотерапию итраконазолом (группа №1), 34 больных - комбинацию итраконазола и таурина (группа №2), 36 больных – комбинацию итраконазола и силибинина (группа №3).

Группы больных, получавших различную терапию онихомикоза, были сопоставимы по основным клинико-демографическим параметрам.

Таблица №1.
Характеристика больных онихомикозом, включенных в исследование

Показатели	Абс.	%
Количество больных	104	100
Муж.	60	57,7
Жен.	44	42,3
Средний возраст, лет	57,54 ±9,8
Масса тела, кг	82,6±7,6
Рост, см	171,2±11,0
Анамнестическая длительность онихомикоза (мес.)
0 - 12	44 (24 муж.,20 жен.)	42,3%
13 - 60	18(14муж.,4жен.)	17,3%
61 - 120	12 (6 муж.,6 жен.)	11,5%
более 120	30 (16 муж.,14 жен)	28,8%
Средняя анамнестическая длительность онихомикоза (мес)	65,3 ±15,8
Поражение ногтевых пластинок пальцев стоп, в т.ч.	80
дистальная форма	28 (10 муж.,18 жен.)	26,9%
тотальная форма	52 (34 муж.,18 жен.)	50,0%
Поражение ногтевых пластинок пальцев кистей, в т.ч.	4
дистальная форма	-
тотальная форма	4 (жен.)	3,8%
Поражение ногтевых пластинок пальцев стоп и пальцев кистей	20
дистальная форма	6 (4 муж.,2 жен.)	5,8%
тотальная форма	14 (12 муж.,2 жен.)	13,5%
Гипертрофический тип поражения	70 (36 муж.,34 жен.)	67,3%
Нормотрофический тип поражения	34 (10 муж.,24 жен.)	32,7%

Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования был одобрен Независимым Комитетом по вопросам этики при ГКБ №23 имени «Медсантруд».

В качестве антимикотического средства использовался итраконазол, в качестве гепатопротекторов - таурин и силибинин.

Итразол (итраконазол) – антимикотический препарат широкого спектра действия, применялся в виде пульс-терапии по 200 мг 2 раза в день после еды в течение 7 дней с перерывом в 21 день. Длительность лечения составила от 2-х до 9 туров терапии.

Дибикор (таурин) производства ООО «ПИК-ФАРМА ПРО», Россия - естественный продукт обмена серусодержащих аминокислот: цистеина, цистеамина, метионина. Назначали в комбинации с итраконазолом, разовая доза составила 500 мг, суточная -1000 мг, кратность приема - 2 раза в сутки за 20 минут до приема пищи.

Силимар (силибинин) производства ЗАО «Фармцентр ВИЛАР» - экстракт расторопши пятнистой в таблетках назначался в комбинации с итраконазолом, разовая доза составила 100 мг, суточная - 300 мг, кратность приема - 3 раза в сутки.

Методы оценки эффективности фармакотерапии онихомикоза

Оценка динамики клинических проявлений онихомикоза проводилась на основании ежемесячных осмотров пациентов. Положительным эффектом фармакотерапии считалось отрастание от проксимального края неизмененного ногтя бледно – розового цвета.

Оценка динамики биохимических показателей функции печени. Оценка динамики биохимических показателей функции печени проводилась до начала терапии и после окончания каждого тура лечения. В динамике изучались показатели АСТ (N=0-40 Ед./л), АЛТ (N=0-40 Ед./л), общий белок (N=65-85 г/л), альбумин (N=35-53 г/л), билирубин общий (N=3,4-20,5 мкмоль/л), билирубин прямой (N?3,4 мкмоль/л), ЩФ (N=0-115 Ед./л), ГГТ (N= 0-38 Ед./л).

В качестве признаков биохимического цитолитического синдрома рассматривалось повышение в плазме крови уровня аминотрансфераз в 1,5-3 раза; биохимического холестатического синдрома - повышение уровня ЩФ более 3-х норм, гамма-ГТ- более 5.

Микологическое исследование ногтевых пластин пальцев стоп и кистей. Исследование ногтевых пластинок на наличие микотического поражения производилось всем больным в клинической лаборатории КВД №15 методом прямой микроскопии с использованием 10% р-ра КОН. Контрольные микроскопические исследования материала с ногтевых пластин больных онихомикозом проводились по достижению клинического излечения с троекратным повтором с интервалом в 3 месяца.

Экспериментальное электрохимическое исследование по влиянию различных гепатопротекторов на активность фермента цитохрома Р450 3А4 проведено в серии опытов с использованием 3 мг белка-фермента с помощью потенциостата AUTOLAB (“Eco Chemie” Нидерланды). Для исследования электроаналитических характеристик использовали вольтамперные отклики электродов, регистрируемые с помощью цикловольтамперометрии и вольтаметрического анализа (квадратно-волновой КВВА и дифференциальной импульсной вольтамперометрии ДИВА). При окислении и (или) гидроксилировании субстратов цитохромов Р450 3А4 в электрохимической системе регистрируется катодный ток, соответствующий дополнительному потоку электронов к органическому субстрату (лекарственному препарату) в системе. Катодный ток (имеющий отрицательное значение в отличие от анодных процессов с положительным значением тока) является мерой электрокаталитической активности фермента.

Активность цитохрома Р450 3А4 оценивалась неинвазивным методом по соотношению концентраций 6β-гидроксикортизола (образуется из кортизола исключительно под действием цитохрома Р450 3А4) и кортизола (6β-гидроксикортизол/кортизол) [D.M. Roberts et al., 2007], концентрации которых в утренней порции мочи определяли методом хромато-масс-спектрометрического анализа по стандартной методике высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Определение равновесной концентрации итраконазола в плазме крови проводили по стандартной методике высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектральной детекцией в конце каждого тура пульс-терапии. Образцы проб крови из вены забирали на 7-й день каждого тура лечения через 3 часа после приема утренней дозы препарата.

Результаты исследований обработаны с помощью пакета программ «SPSS 11.5 for Windows». Для нормально распределенных показателей данные представлены в виде М±σ, где М – среднее значение, σ – стандартное отклонение. Сравнение количественных показателей проводили при помощи рангового U-образного критерия Манна-Уитни. При анализе повторных измерений количественных признаков применяли критерий Вилкоксона. Статистически значимыми считались различия при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Экспериментальное электрохимическое исследование влияния итраконазола и гепатопротекторов на активность цитохрома Р450 3А4.

Результаты экспериментального изучения влияния итраконазола на электрохимическую активность цитохрома Р450 3А4 показали, что при добавлении итраконазола к DDAB/Au/P450 3А4 электроду не наблюдается увеличения катодного каталитического тока. Так, среднее значение тока DDAB/Au/P450 составило -0,913±0,209 μА (100%), при добавлении итраконазола к DDAB/Au/P450 3А4 электроду - 0,833±0,167 μА (91,2%). Полученные результаты можно объяснить проявлением не только субстратных, но и ингибирующих свойств итраконазола по отношению к цитохрому Р450 3А4. 11

Проведено изучение в электрохимическом эксперименте влияния таурина на электрохимическую активность цитохрома Р450 3А4. Оценка проводилась с помощью анализа отклика фермента на вещество-модулятор. При добавлении таурина (конечная концентрация 50 мкМ) к DDAB/Au/P450 3А4 электроду наблюдается увеличение катодного тока, что обычно характерно для субстратов цитохрома Р450.

Для доказательства отсутствия связывания таурина с цитохромом Р450 по типу субстратов были исследованы разностные спектры поглощения цитохрома Р450 в присутствии диклофенака, итраконазола и таурина. Спектр поглощения гемопротеина имеет характерный максимум при 420 нм.

Разностный спектр связывания с диклофенаком имеет характерную форму для связывания субстратов I типа: с максимумом при 380 нм и минимумом при 416 нм (рис.№1). Итраконазол дает разностный спектр связывания II типа, характерный для соединений - ингибиторов с максимумом при 420 нм и минимумом при 390 нм (рис №2). Таурин не дает характерных разностных спектров связывания ни I, ни II типа (рис.№3), что доказывает отсутствие у него субстратных свойств.

Увеличение каталитического тока при прибавлении таурина можно объяснить антиоксидантными свойствами этого соединения. В результате электрокаталитического восстановления цитохрома Р450 3А4 происходит генерирование активных форм кислорода, что в соответствии с механизмом каталитического действия цитохрома может приводить к частичной инактивации фермента. Антиоксидантные свойства таурина проявляются в нейтрализации этих активных форм кислорода, что приводит к стабилизации фермента и увеличению восстановительного катодного тока. Ингибирующее действие итраконазола (в концентрации 10 мкМ) в присутствии 50 мкМ таурина существенно снижается.

В экспериментах по схеме «итраконазол затем таурин», итраконазол, как и следует ожидать, ингибирует цитохром Р450 3А4, что проявляется в отсутствии увеличения каталитического тока (102%). Добавка таурина к DDAB/Au/P450 3А4 электроду в присутствии итраконазола дает прирост регистрируемого катодного тока (131,7%), то есть, таурин нивелирует ингибирующее действие итраконазола на цитохром Р450.

Таким образом, используя электрохимическое восстановление цитохрома Р450 3А4 в качестве инструмента для исследования электрокаталитической активности гемопротеина и влияния на активность цитохром Р450-содержащую систему различных биологически активных веществ, можно сделать вывод: таурин положительно влияет на электрокаталитическое восстановление цитохрома Р450 3А4. При этом таурин снижает ингибирующий эффект итраконазола.

При добавлении силибинина к DDAB/Au/P450 3А4 электроду не наблюдается увеличения катодного каталитического тока. Так, среднее значение тока DDAB/Au/P450 составило -0,838±0,109?А (100%), при добавлении силибинина к DDAB/Au/P450 3А4 электроду - -0,894±0,311 μА (106,7%). При последующем добавлении итраконазола также не отмечено увеличения каталитического тока: среднее значение составило -0,868±0,276 μА (103,6%). Результаты электрохимического анализа показали, что силибинин не оказывает существенного влияния на активость цитохрома Р450 3А4 и не снижает ингибирующий эффект итраконазола.

Средние значения катодного каталитического тока под влиянием различных комбинаций субстратов, ингибиторов и модуляторов CYP450 3А4 представлены в табл. № 2.

Таблица №2.
Средние значения катодного каталитического тока под влиянием различных комбинаций субстратов, ингибиторов и модуляторов CYP450 3А4

№	Система	Значение тока, μА	Значение тока, %	р
1.	3А4	-1,092±0,212	100
	3А4+итраконазол	-1,120±0,198	104,2
2.	3А4	-0,913±0,209	100
	3А4+интраконазол	-0,833±0,167	91,2
	3А4+итраконазол +диклофенак	-0,827±0,234	90,6
3.	3А4	-0,915±0,200	100
	3А4+таурин	-0,985±0,199	107,7
	3А4+таурин+итраконазол	-1,205±0,261	131,7	<0,05
	3А4 +итраконазол+таурин	-0,933±0,167	102,0
4.	3А4	-0,838±0,109	100
	3А4+силибинин	-0,894±0,311	106,7
	3А4+силибинин+итраконазол	-0,868±0,276	103,6

Приведены средние значения пяти экспериментов.

Динамика клинических проявлений заболевания под влиянием итраконазола и комбинаций его с гепатопротекторами

Все больные завершили курс системной терапии. Эффективность проведенного лечения составила 100%, однако длительность системной терапии онихомикоза была различной (табл. № 3).

Таблица №3.
Распределение больных онихомикозом в зависимости от вида и длительности проводимой терапии итраконазолом

Достоверных различий по длительности терапии в группах больных, получавших итраконазол в виде монотерапии и в комбинации с различными гепатопротекторами, выявлено не было. Среднее количество туров итраконалоза в расчете на 1 больного составило 6,29±1,2.

Динамика биохимических показателей функции печени под влиянием терапии итраконазолом и комбинации его с гепатопротекторами
У больных 1 группы, получавших лечение только итраконазолом, выявлена прямая коррелятивная зависимость между уровнем АЛТ и количеством туров терапии. Коэффициент корреляции составил 0,98. При проведении парного сравнения непараметрическим тестом Вилкоксона установлено, что статистически достоверное различие уровня АЛТ по сравнению с исходным значением этого показателя отмечается у больных после 3-го тура лечения итраконазолом (р<0,05). После 6-го тура терапии отмечено статистически достоверное различие уровней АЛТ по сравнению с результатами по окончании 3-го тура терапии (р<0,05). После 7-го тура лечения итраконазолом отмечено статистически достоверное различие уровня АЛТ по сравнению с результатами, полученными после 6-го тура терапии (р<0,01). По окончании 8-го тура терапии уровень АЛТ был выше установленной нормы. В среднем по группе (n=5) величина значения АЛТ составила 103,5±3,4 ед.

По окончании 9-го тура у всех больных 1 группы отмечено дальнейшее увеличение АЛТ. В среднем по группе (n=3) величина значения АЛТ составила 153,5±3,4 ед., что более чем в 3 раза превышает уровень установленной нормы. Увеличение уровня АЛТ по сравнению с окончанием 8-го тура лечения составляет 1,5 раза. После окончания 8-го тура терапии итраконазолом уровень АЛТ у всех больных превышал нормальные значения. После проведения 9-го тура терапии уровень АЛТ превышает установленную норму в 3,4 раза (рис.4).

У больных 2 группы («итраконазол + таурин») не выявлено коррелятивной зависимости между уровнем АЛТ и количеством туров терапии (r=0,5), нарастания уровня АЛТ в плазме крови выявлено не было.

У больных 3 группы («итраконазол + силибинин») выявлена прямая коррелятивная зависимость между уровнем АЛТ и количеством туров терапии (r=0, 93), отмечается нарастание уровня АЛТ в плазме крови после 4-го тура лечения. К концу 9-го тура терапии уровень АЛТ сохранялся на верхней границе нормы.

У больных онихомикозом, получавших лечение только итраконазолом, выявлена прямая коррелятивная зависимость между уровнем АСТ и количеством туров терапии. Коэффициент корреляции составил 0,93. Изменение уровня АСТ в Δ% по отношению к исходу носит однонаправленный характер в сторону повышения уровня АСТ в каждом последующем туре по сравнению с предыдущим.

Во 2 группе не выявлено коррелятивной зависимости между уровнем АСТ и количеством туров терапии (r=0,52). Изменение уровня АСТ в Δ% у больных, получавших итраконазол + таурин, не носило значимого направленного характера.

При применении комбинации итраконазола и силибинина турами длительностью в 1 неделю с перерывом между турами в 3 недели, отмечается нарастание уровня АСТ в плазме крови пациентов в основном после 4-го тура. После 8-го тура терапии у всех пациентов уровень АСТ превысил нормальное значение. После 9-го тура терапии увеличение АСТ по сравнению с исходным значением отмечено более чем в 9,7 раза; по сравнению 4-м туром - более чем в 8,8 раза, по сравнению с 7-м туром - в 7,2 раза ( рис. 5).

После 1-го тура терапии итраконазолом отмечено достоверное повышение уровня ЩФ в плазме крови с 79,84±5,2 до 102,34±6,3 ед (р<0,05). На протяжении дальнейшего лечения отмечается рост данного показателя. Коэффициент корреляции количества туров и уровня ЩФ составляет 0,76. По окончании 7-го тура уровень ЩФ в среднем по группе пациентов, получавших лечение итраконазолом, был выше установленной нормы и составил 115,83±7,1 ед. После проведения 8-го и 9-го туров терапии итраконазолом отмечено дальнейшее повышение уровня ЩФ, которое в среднем по группе не явилось статистически значимым по отношению к среднему значению по группе после 7-го тура. За период наблюдения отмечено увеличение данного показателя в 1,48 раза (на 48,3Δ%).

У больных онихомикозом, получавших лечение комбинацией препаратов итраконазол+таурин, за период наблюдения не произошло достоверных изменений данного показателя. После первого тура терапии в группе больных, получавших терапию итраконазолом в комбинации с силибинином, в среднем по группе произошло достоверное повышение уровня ЩФ по отношению к исходному значению (соответственно 89,2±4,2 и 77,1±3,8) (р<0,05). На протяжении дальнейшего лечения отмечается рост данного показателя. Коэффициент корреляции количества туров и уровня ЩФ составляет 0,96. По окончании 7-го тура терапии уровень ЩФ в среднем по группе больных находится практически на верхней границе установленной нормы - 112,2±6,2ед. По окончании 8-го и 9-го туров терапии не отмечено значимого изменения уровня ЩФ по сравнению с предыдущим значением (рис.6).

После 1-го тура терапии итраконазолом отмечено статистически значимое повышение уровня гамма-ГТ в крови с 25,09±1,8 до 32,05±2,3 ед (р<0,05). На протяжении дальнейшего применения препарата до 5-го тура не отмечается существенных колебаний данного показателя. После 7-го тура отмечается некоторое статистически незначимое увеличение гамма-ГТ до 36,4±2,9 ед. После окончания 8-го тура лечения итраконазолом гамма-ГТ в среднем по группе находится практически на верхней границе нормы и составило 46,9±4,3 ед. После 9-го тура лечения отмечается дальнейшее повышение этого показателя до 56,8±4,5 ед. За время проведения терапии, уровень гамма-ГТ в группе пациентов, получавших только итраконазол, повысился в 2,3 раза (на 126,5 ?%).

У больных онихомикозом, получавших лечение комбинацией препаратов итраконазол+таурин, за период наблюдения не произошло значимых изменений содержания гамма-ГТ.

У больных онихомикозом, получавших терапию итраконазолом в комбинации с силибинином, в среднем по группе произошло повышение уровня гамма-ГТ с 25,4±2,4 до 38,8±5,1, что явилось статистически значимым. За период наблюдения уровень гамма-ГТ повысился в этой группе пациентов в 1,33 раза (на 52,75 Δ%) (рис.7).

Таким образом, биохимические признаки холестатического синдрома наиболее выражены у больных онихомикозом, принимавших итраконазол в виде монотерапии. Биохимические признаки холестатического синдрома нарастают по мере длительности терапии итраконазолом. В группе больных онихомикозом, получавших терапию итраконазолом в комбинации с силибинином, биохимические признаки холестатического синдрома выражены несколько слабее, по сравнению с группой больных, получавших только итраконазол. В группе больных, принимавших итраконазол в комбинации с таурином, биохимические признаки холестатического синдрома отсутствуют.

Оценка активности цитохрома Р450 3А4 неинвазивным методом по соотношению 6β- гидроксикортизол/кортизол в моче у больных онихомикозом на фоне проводимой терапии итраконазолом и в комбинации с гепатопротекторами

В среднем по группе больных, получавших лечение итраконазолом, соотношению концентраций 6β- гидроксикортизола и кортизола (6β- гидроксикортизол /кортизол) в утренней порции мочи составило до начала терапии 2,68±0,2. После проведения 1-го тура терапии отмечено статистически значимое снижение его значения до 2,23±0,1 (t=2,04; р<0,05).

В дальнейшем при проведении туров терапии также отмечается снижение коэффициента, которое в связи с выраженной индивидуальной вариабельностью значений не является статистически значимым. Однако, при проведении парного сравнения непараметрическим тестом Вилкоксона установлено статистически значимое снижение значения соотношения 6β- гидроксикортизол /кортизол от тура к туру на протяжении всего периода наблюдения у пациентов, получавших монотерапию итраконазолом.

При проведении терапии итраконазолом в комбинации с силибинином после 1-го тура лечения отмечается статистически незначимое снижение величины соотношения 6β- гидроксикортизол /кортизол с 2,74±0,2 до 2,61±0,2. При проведении парного сравнения непараметрическим тестом Вилкоксона у больных этой группы выявлено достоверное снижение значения соотношения 6β- гидроксикортизол /кортизол после проведения 4-го тура терапии (среднее по группе значение составило 2,24±0,2).

Однако, при сравнении полученных результатов необходимо отметить более низкую степень ингибирования CYP 450 3А4 в группе больных онихомикозом, принимавших итраконазол в комбинации с силибинином. Значение соотношения 6β- гидроксикортизол /кортизол в группе больных, принимавших итраконазол в комбинации с силибинином, существенно превосходит значение этого соотношения при приеме только итраконазола во всех контрольных временных точках, начиная с 1-го тура терапии (рис.№8, табл.№4).

Таблица №4.
Динамика соотношения концентраций 6β-гидроксикортизола и кортизола в утренней порции мочи больных онихомикозом на фоне проводимого лечения

Терапия	Длительность терапии (туры)
	исход	1		4		6		После лечения
			Δ%		Δ%		Δ%		Δ%
итраконазол	2,68 ± 0,2	2,23 ± 0,1*	-16,8	1,98 ± 0,2*	-26,11	1,5 ± 0,2*	-44,02	1,1 ± 0,1*	-58,9
Итраконазол + силибинин	2,74 ± 0,2	2,61 ± 0,2	-4,7	2,45 ± 0,2	-18,24	2,1 ± 0,1*	-23,35	1,9 ± 0,2*	-0,65
Итраконазол + таурин	2,59 ± 0,1	2,54 ± 0,2	-1,9	2,6 ± 0,3	0,3	2,62 ± 0,2	3,0	2,8 ± 0,3	8,1

* статистически достоверно по отношению к исходному значению.

В группе больных онихомикозом, принимавших итраконазол одновременно с таурином, не отмечено значимого изменения величины соотношения 6β- гидроксикортизол /кортизол независимо от продолжительности проводимой терапии. Отмечено статистически незначимое увеличение соотношения 6β- гидроксикортизол /кортизол, особенно в период времени, начиная с 4-го тура терапии.

РИС. №8. ДИНАМИКА СООТНОШЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ 6β- ГИДРОКСИКОРТИЗОЛА И КОРТИЗОЛА В МОЧЕ У БОЛЬНЫХ ОНИХОМИКОЗОМ НА ФОНЕ ТЕРАПИИ ИТРАКОНАЗОЛОМ И КОМБИНАЦИИ ЕГО С ГЕПАТОПРОТЕКТОРАМИ

Полученные данные по динамике коэффициента 6β- гидроксикортизол /кортизол в суточной мочи, позволяют предположить наличие у таурина свойств, модулирующих активность цитохрома Р450 3А4. Полученные данные по выявлению активности цитохрома Р450 3А4 согласуются с результатами собственных электрохимических экспериментальных данных. Добавление таурина к терапии итраконазолом позволяет нивелировать ингибирующее действие итраконазола на цитохром P450 3А4 независимо от длительности проводимой терапии.

Динамика изменения максимальной равновесной концентрации итраконазола в плазме крови больных онихомикозом на фоне проводимой пульс-терапии

В конце каждого тура пульс-терапии итраконазолом проводилось определение максимальной равновесной концентрации препарата в крови. Образцы проб крови из вены забирали на 7-й день лечения каждого тура через 3 часа после приема утренней дозы препарата. Динамика максимальной равновесной концентрации итраконазола в плазме крови больных онихомикозом на фоне проводимой пульс-терапии представлены на рис.9.

Проведенное изучение динамики максимальной равновесной концентрации в конце каждого тура терапии позволило установить, что у всех больных онихомикозом, получающих гепатопротекторы, концентрация итраконазола в плазме крови была в диапазоне терапевтических значений (2-10 мкг/мл). При этом необходимо отметить, что при проведении комбинированной терапии итраконазол+таурин отмечено статистически незначимое повышение максимальной равновесной концентрации итраконазола по мере увеличения количества туров терапии (от 2,2±0,3 до 3,0±0,4 мкг/мл).

При применении итраконазола в виде монотерапии достоверное увеличение максимальной равновесной концентрации препарата отмечено после 5-го тура терапии (3,1±0,4 мкг/мл), при применении комбинации итраконазол+силибинин - после 7-го тура (3,7±0,6 мкг/мл).

По окончании периода наблюдения (9 туров) равновесная концентрация итраконазола в плазме крови больных, получавших терапию итраконазол+таурин, была достоверно ниже (3,0±0,4 мкг/мл) равновесной концентрации в группе пациентов, получавших комбинацию итраконазол+силибинин (4,8±0,8 мкг/мл) и монотерапию итраконазолом (6,1±0,6 мкг/мл).

ВЫВОДЫ

1.По данным электрохимического эксперимента таурин не является субстратом изоформы цитохрома Р450 3А4

2.Таурин снижает ингибирующий эффект итраконазола на цитохром Р450 3А4: в опытах по схеме «итраконазол + таурин» нанесение таурина на DDAB/Au/P450 3А4 электрод в присутствии итраконазола дает достоверный прирост регистрируемого катодного тока (139%).

3.Силибинин не влияет на активность цитохрома Р450 3А4 и не снижает ингибирующий эффект итраконазола. При нанесении силибинина на DDAB/Au/P450 3А4 электрод не наблюдается увеличения катодного каталитического тока.

4.Установлено наличие обратной коррелятивной зависимости (r = -0,97) между длительностью монотерапии итраконазолом и величиной значения соотношения 6β- гидроксикортизол /кортизол.

5.Определение активности цитохрома Р450 3А4 неинвазивным методом по тесту соотношения 6.-гидроксикортизола/ кортизол в моче подтверждает наличие у таурина свойства снижать ингибирующий эффект итраконазола на цитохром Р450 3А4: значимого изменения соотношения 6β- гидроксикортизол /кортизол у больных онихомикозом, получавших комбинацию «таурин+итраконазол» не отмечено, что согласуется с данными литературы.

6.Равновесная концентрация итраконазола в плазме крови больных онихомикозом находилась в диапазоне терапевтических значений (2-10 мкг/мл) независимо от проводимой терапии. К концу периода наблюдения концентрация итраконазола в плазме крови в группах больных, получавших монотерапию итраконазолом (6,1±0,6 мкг/мл) и комбинацию «итраконазол+силибинин» (4,8±0,8 мкг/мл) статистически достоверно превышала этот показатель в группе больных, находившихся на терапии «итраконазол+таурин» (3,0±0,4 мкг/мл).

7.Эффективность проводимой системной терапии итраконазолом у больных онихомикозом составила 100% и не зависела от выбора гепатопротектора. Средняя длительность системной терапии онихомикоза была сопоставимо одинакова во всех группах и составила 6,21±1,3; 6,40±1,1 и 6,28±1,2 туров для больных, получавших итраконазол, комбиницию «итраконазол + таурин» и комбинацию «итраконазол+ силибинин» соответственно (р>0,05, р>0,05).

8.На фоне проводимой монотерапии итраконазолом и итраконазолом в сочетании с силибинином у больных онихомикозом после 6 тура терапии отмечалось гепатотоксическое действие итраконазола, проявляющееся в биохимических признаках цитолиза и холестаза. В группе больных, получавших итраконазол в сочетании с таурином, независимо от длительности проводимой терапии, достоверных биохимических признаков цитолиза и холестаза выявлено не было

Практические рекомендации

Таурин может быть использован в качестве средства, предупреждающего снижение активности изофермента цитохрома Р4503А4 при проведении фармакотерапии итраконазолом у больных с онихомикозом.

С целью повышения безопасности длительного лечения системными антимикотиками, в частности, итраконазолом, предпочтительным является выбор таурина в качестве гепатопротектора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Толмачев А.В., Ших Е.В., Сизова О.С. - Угрожающие жизни дерматологические нежелательные лекарственные реакции у пациентов, получающие психотропные лекарственные средства. //Журнал «Клиническая фармакология и терапия», материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения клинической фармакологии в России», 2009, №6 (дополнит), с. 64.
2.Ших Е.В., Сизова О.С., Толмачев А.В. - Пиковит: клинико-фармакологические аспекты. //Русский медицинский журнал, 2009, №19(358), с. 1269-1272.
3.Сизова О.С., Ших Е.В., Потекаев Н.Н. - Фармакологическая регуляция активности CYP3А4 гепатопротеторами как перспективный путь уменьшения гепатотоксичности притивогрибковых препаратов при лечении онихомикозов. //Журнал «Биомедицина», 2010, №2, с.4-15.
4.Махова А.А., Шумянцева В.В., Ших Е.В., Булко Т.В., Кукес В.Г., Сизова О.С.. Раменская Г.В.. Арчаков А.И. - Влияние витаминов группы В на монооксигеназную активность цитохрома CYP3А4: электроанализ каталитических свойств. //Журнал «Биомедицина», 2010, №3, с.99-100.
5.Сизова О.С., Шумянцева В.В., Ших Е.В. - Влияние гепатопротекторов на ингибирующую активность противогрибкового препарата итраконазола: фармакокинетические исследования и электроанализ каталитических свойств.// 1-я Всероссийская научно- практическая дистанционная конференция «Ивановские чтения», 14-15 октября 2010г., Москва, с. 66-67.
6.Сизова О.С., Потекаев Н.Н., Жуковский Р.О., Ших Е.В. - Возможности снижения гепатотоксичности итраконазола при комбинированном назначении с таурином у больных онихомикозом. //Клиническая дерматология и венерология, 2011г., №1, с.45-49.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
АГ - артериальная гипертония
АЛТ - аланинтрансаминаза
АСТ - аспартаттрансаминаза
ВС - внутренний ситандарт
ДМСО - диметилсульфоксид
ИБС - ишемическая болезнь сердца
М – среднее арифметическое
ЩФ - щелочная фосфатаза
CV - цикловольтамперограмма
DDAB - дидодецилдиметиламмоний бромид
n – количество обследованных лиц в группе
Lg – десятичный логарифм
р – уровень значимости
r – коэффициент корреляции
Δ% - процент изменения показателя по отношению к исходу