Опубликовано в:
«ВЕСТНИК ВОЛГМУ» »» 2008 Выпуск № 1 (25)

Зависимость выраженности дезагрегационых эффектов дибикора от его плазменных концентраций у больных сахарным диабетом типа 2

Н.Б. Рогова, А.А. Бочарников
Волгоградский Гэсударственный Медицинский Университет, кафедра клинической фармакологии

С использованием малоуглового рассеяния на приборе «Light Scan» изучена взаимосвязь между интенсивностью дезагрегационного эффекта дибикора и его плазменной концентрацией у больных сахарным диабетом. Метод позволяет получить точные и воспроизводимые результаты.

Ключевые слова: агрегация тромбоцитов, малоугловое светорассеяние, дибикор, АДФ.

Dependence Between Intensity Of Desegregations Effect Of Dibicor And Its Plasma Concentration In Patient's With Diabetes Mellitus

N. V. Rogova, A. A. Bocharnikov
Volgograd State Medical University; chair of Clinical Pharmacology

Correlation between intensity of desegregations effect of dibicor and its plasma concentration in patient's with diabetes mellitus was studied using the method of low-angle light scattering on «Light-Scan». The method produced accurate and repeatable results.

Keywords: platelet aggregation, low-angle light detection, ADP, dibicor

В Росси смертность от сердечно-сосудистых заболеваний составляет - 56,4 % от общего количества смертей. Ежегодно - 20 млн. случаев заболеваний в мире связаны с патологией сердечно-сосудистой системы, каждый 4-й со смертельным исходом. С такими темпами к 2020 году численность больных увеличиться до 7,6 млн в год. Наибольшая частота встречаемости летальных исходов от сердечно-сосудистых заболеваний отмечена среди больных сахарным диабетом в Китае, Восточной Европе, России. В России ежегодно насчитывается - 0,5 млн человек страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями, из них только 1/5 к нормальной жизнедеятельности, остальные - инвалидизация или смерть (многоцентровое исследование «PROGRESS» 2001 г).

Сахароснижающие средства в той или иной степени выраженности обладают эффектами улучшающими гемореологию. В последние годы широко применяется дибикор в терапии сахарного диабета типа 2.

В связи с тяжелыми сердечно-сосудистыми осложнениями сахарного диабета типа 2, возникает необходимость контроля реологических свойств крови. Существуют различные методы и методики контроля параметров реологических свойств крови. Например такие как:

• регистрация параметров реологических свойств крови при помощи ротационного вискозиметра АКР-2 при скоростях сдвига от 300 с^-1 до 3 с^-1, моделирующих интенсивность кровотока в сосудах разного калибра;
• агрегацию тромбоцитов и влияние на неё препаратов изучают на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов фирмы «Solar», «Биола», с индуктором агрегации динатриевой солью аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ). Оценку спонтанной и индуцированной агрегации тромбоцитов проводят по кривым относительного среднего радиуса агрегатов с вычислением степени и скорости агрегации;
• агрегационная активность тромбоцитов анализируется на агрегометре «Трамлайт». Возможна оценка показателей: время достижения максимальной агрегации, степень агрегации и дезагрегации;
• агрегацию тромбоцитов проводят на приборе «Лайт-Скан», регистрируя малоугловое светорассеяние. Возможна оценка параметров: время достижения максимальной агрегации, - степень агрегации и дезагрегации, степень активации тромбоцитов (стадия сферизации и образование псевдоподий).

Таким образом «Лайт-Скан» позволяет оценить большее количество параметров.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Оценить влияние фармакокинетики дибикора на выраженность его дезагрегационых эффектов с помощью адаптированной методики регистрации активации и агрегации тромбоцитов человека (разработанную Э.Ф. Дергачевым и др.[4]).

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование было включено 16 пациентов с сахарным диабетом типа 2, средней степени тяжести в состоянии субкомпенсации углеводного обмена. До включения в исследование «отмывочный период» составил 5 Т½. До и после лечения проводилось исследование реологических свойств крови.

Всем пациентам назначался дибикор по 500 мг 2 раза в день на 14 дней. Затем хроматографически определяли концентрации дибикора [хроматограф модели «HPLC-IOAvp» (Shimadzu Co., Ltd., Kyoto, Japan), оборудованный диодно-матричным детектором SPD-МЮА (Shimadzu Co., Ltd., Japan) и инжектором «Rheodyne модели 7725»; с петлей ввода на 20 мкл (Rheodyne, Cotati, СА 94928), хроматографическая колонка «SupelcoSil LC-8» (7,5 см х 4,6 мм со средним размером частиц 3 мкм)] и реологические свойства крови.

До начала исследования нами была разработана методика определения реологических свойств крови на аппарате «Лайт-Скан».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

За основу была взята модификация методики Э.Ф. Дергачева и др. [4], использующаяся в экспериментах на животных на кафедре фармакологии ВолГМУ [1]. При воспроизведении данной методики у людей были получены следующие результаты приведенные на рис. 1:

Рис. 1. Агреготограмма при рН 9,0

Картины агрегации не наблюдалось, это мы связали с тем, что необходимо более точно подобрать среду (буфер). рН получаемого буфера составлял 8,9-9,2. Согласно литературным данным скорость агрегации максимальна при рН среды 7,8, и уменьшается при закислении среды. При рН 6,0 агрегация отсутствует [2]. Поэтому рН буфера довели до 7,8 0,1 М раствором НС1.

После преобразований видно, что агрегация проходит спонтанно. Это можно связать с тем, что кровь активировалась уже в шприце после прохождения через иглу, плюс воздействие отрицательного давления под поршнем. Поэтому приняли решение о необходимости забора крови самотеком, предварительно наполнив иглу раствором цитрата натрия. Первые 2-3 капли крови собирали в отдельную пробирку, так как кровь при первом прохождении через иглу может активироваться клетками тканевых покровов. Затем брали другую пробирку с 0,5 мл цитрата натрия и набирали кровь до отметки 5 мл. Активацию плазмы до эксперимента мы связали с наличием загрязнений на внутренней поверхности пробирок, а так же наличия мелких царапин. Пробирки должны быть максимально чистыми и абсолютно с ровными и гладкими поверхностями.

После соблюдения этих условий мы получили агрегатограмму без спонтанной агрегации. Однако при добавлении АДФ мы не видели стадии активации тромбоцитов, а сразу шла стадия агрегации. Мы предположили, что наличие Са в среде ускоряет агрегацию и мы не видим стадии активации. Поэтому был приготовлен буферный раствор с ЭДТА и без Са²⁺. Получили акгиваци, но при последующем добавлениии в эту среду ионов Са²⁺ в физиологической концентрации агрегации не наблюдали, что связано с переходом тромбоцитов в рефрактерное состояние [2]. Для решения этой задачи необходимо в экспериментах использовать два буферных раствора: с Са²⁺ и без Са²⁺.

Чтобы определить концентрацию АДФ, которая вызывает максимальную агрегацию тромбоцитов в кальциевой среде, мы титровали раствор АДФ. По литературным данным на поверхности тромбоцитов имеется 3 подтипа Р2-рецепторов: Р2Х1-, Р2У1-И Р2У12-рецепторы[6]. Для прохождения агрегации необходима активация Р2У12-рецепторов. Последовательность действия АДФ на Р2-рецепторы тромбоцитов располагается в следующем порядке: ЕС50Р2Х1<EC50P2YK<<ЕС50Р2У12[2].

Проведена количественная оценка действия пуринов на процессы активации и агрегации тромбоцитов крысы и кролика методом малоуглового светорассеяния [2]. Получены значения ЕС50 АДФ, вызывающие активацию и агрегацию и отражающие последовательность действия агониста на Р2ХЬрецепторы (20-40 нМ), Р2У1-рецепторы (90-110 нМ) и Р2У12-рецепторы (120-240 нМ) [2]. Так как для прохождения агрегации необходима активация Р2У12-рецепторов, то растворы АДФ титровали от 100 до 400 нМ. Данные экспериментов отражены на рис. 2. Оптимальное количество АДФ - 200 нМ.

Рис. 2. Титры растворов АДФ

С помощью разработанной методики у всех пациентов были определены параметры, позволяющие характеризовать гемореологические свойства крови (до и после курсовой терапии дибикором).

После курсовой терапии наблюдали улучшение реологических свойств крови. Данные представлены в таблице.

Параметры	n	До лечения	После лечения	Р	А
		Mi+m	М2+т		В%к М
Вязкость крови:
200	16	6,2±0,16	5,2±0,10	<0,05	-16%
150	16	6,5±0,12	5,9±0,11	<0,05	-9%
100	16	6,5±0,09	6,2±0,11	<0,05	-4%
50	16	7,1±0,14	6,9±0,12	<0,05	-3%
40	16	7,3±0,09	7,0±0,09	<0,05	-4%
30	16	8/7+ОД2	8,3±0,08	0,05	-5%
20	16	10,3±0,14	9,9±0,12	<0,05	-3%
гематокрит	16	0,44±0,01	0,45±0,01	>0,05	2%
Агрегация тромбоцитов [АДФ]2,5 мкМ
Степень агрегации, %	16	43,28±12,34	19,09±10,45	<0,05	-56%
Ттах., с	16	202,12±117,23	199,52±99,45	>0,05	-1,3%
Скорость 30 с,%/с	16	34,53±4,13	26,12±3,46	<0,05	-24%
% дезагрегации	16	44,5±7,17	61,04±8,51	<0,05	+37%
Тип агреготограммы:
Однофазная обратимая	16	54,12%	55,44%
Двухфазная	16	21,15%	23,13%
Двухфазная сливная	16	16,58%	21,43%
Спонтанная агрегация	16	8,15%	0%
Агрегация тромбоцитов [АДФ]200 нМ (Лайт-Скан)
Степень агрегации, %	16	75,12±10,34	48,32±8,45	<0,05	-35,7%
Угол a, arctg (Vn/V0), u	16	43,3±2,34	61,07±5,12	>0,05	+0,9%

Хроматографическое определение концентрации дибикора в крови показало наличие линейной зависимости между концентрацией дибикора и выраженностью дезагрегационного эффекта.

Кроме того, у всех пациентов на терапии дибикором достигнута компенсация углеводного обмена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подобранны оптимальные условия проведения агрегации и активации плазмы, индуцированную АДФ, на приборе «Лайт-Скан». Для регистрации активации: солевая среда (140 mM NaCI, рН 7,8 Трис-буфер, ЭДТА - 5тМ, при концентрации тромбоцитов около 106 кп/ мл.), АДФ 200 нМ - оценивается изменением величины прироста сигнала (А) в I¹². В солевой среде (140 mM NaCI, рН 7,8 Трис-буфер, [Са²⁺] - 1тМ, при концентрации тромбоцитов около 106 кл/мл.) агрегация, регистрируемая по светорассеянию в I² градусном угле, носит однофазный характер. Такой вид кривой (рис.3) дает возможность характеризовать агрегацию углом наклона между этой кривой (V_n) и начальной скоростью агрегации (V₀). Чем острее этот угол, тем хуже агрегация.

Рис. 3. Агреготрграмма при АДФ 200нм

Метод позволяет мониторировать реологические свойства крови при различных патологических состояниях. Мы будем использовать данную методику в нашей дальнейшей работе по изучению реологических свойств крови у больных сахарным диабетом типа 2, у которых особенно высок риск смертности от сосудистых осложнений.

Проведенное исследование показало, что используемый в терапии сахарного диабета дибикор обладает выраженной дезагрегационной эффективностью.

Установлена линейная зависимость между концентрацией дибикора и выраженностью его дезагрегационного эффекта.

Список использованной литературы

1. Деркачев Э.Ф., Миндукшее И.В Криеченко А.И. и др. Патофизиология микроциркуляции и гемостаза. - СПб., 1998.
2. Деркачев Э.Ф., Миндукшее И.В., КриеченкоА. И., и др. Способ исследования активации и агрегации тромбоцитов. Патент RU 2108579 С1 6 GO I N33/49 (1996).
3. Миндукшее И.В. Исследование кинетики активации и агрегации тромбоцитов методом малоуглового светорассеивания: автореф. дисс. - СбПГУ, 1996.
4. Стукоевина А. Ю., Черников М. В., Гоечко О. Ю. Тез. докл. VIII Регион, конф. молодых исследователей Волгоградской области. - Волгоград, 2003.
5. Сакаев М. Р., Миндукшее И. В., Лесиовская Е. Е. и др. // Эксперим. и клинич. фармакол. - 2000. - №3.
6. Ralevic V., BumstockJ. // Pharmacol. Rev. -1998. - Vol. 50, № 3. - P. 415-492.