Опубликовано в журнале:
№ 3 (14), 1999 - »» В ЗИМУ - БЕЗ ГРИППА. ВАКЦИНАЦИЯ - ОСНОВНОЙ МЕТОД БОРЬБЫ С ГРИППОМ.

I. CHALOUPKA, A. SCHULER, М. MARSCHALL, Н. MEIER-EWERT

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ

ШЕСТЬ ЕВРОПЕЙСКИХ ПРОТИВОГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН (Дано в сокращении. Полностью опубликовано в Eur. J. Microbiol. Infect. Dis., 1996, 15:121-127.)

Три расщепленно-вирусные вакцины (Vaxigriр, Begrivac и Ruarix) и три вакцины, приготовленные из поверхностных вирусных гликопротеинов (Influvac, Agrippal и Ruvirin) сезона 1994-1995 гг., подвергли анализу биологическими, молекулярными и биохимическими методами (Приведенные в статье данные основаны на результатах исследования вакцин сезона 1994-1995 гг. Состав некоторых описанных вакцин мог измениться).

В отличие от других вирусов, используемых для приготовления вакцин, в вирусах гриппа происходят стремительные и непредсказуемые антигенные изменения мономерного гемагглютинина (ГА) и нейраминидазы (НА) - двух поверхностных гликопротеинов, являющихся основными стимуляторами выработки нейтрализующих антител в ходе инфекции. На основе существования этих поверхностных антигенов вирусы группы А делят на подтипы. Заражение вирусом, относящимся к какому-либо подтипу, не обеспечивает значительную иммунную защиту от вирусов других подтипов. Хотя вирусы группы В обладают более высокой стабильностью антигенов, чем вирусы группы А, им также свойственны антигенные различия. На основании описываемых в справочниках Всемирной организации здравоохранения антигенных характеристик циркулирующих вирусов осуществляется селекция штаммов для производства ежегодных вакцин. Обычно они содержат три вирусных штамма (2 вируса группы А подтипов Г1Н1 и ГЗН2 и 1 вирус группы В), представляющих наиболее распространенные патогенные вирусы, циркулировавшие в человеческих популяциях в предшествующем сезоне.

В субъединичных вакцинах (Influvac, Agrippal, Fluvirin) общее количество белка было ниже, чем в расщепленно-вирусных вакцинах (Vaxigriр, Begrivac и Fluarix). Содержание белка было наиболее высоким в Fluarix и Vaxigriр - соответственно 99 и 93 мкг на дозу 0,5 мл. Fluvirin содержал наименьшее количество белка - 46 мг на дозу.

Результаты измерения относительного состава мономерного гемагглютинина (ГА), матриксного (М) белка, нейраминидазы (НА) и нуклеопротеина (НП) методом сканирования белкового геля показаны в таблице 1.

Таблица 1. Содержание отдельных вирусных белков в изучаемых противогриппозных вакцинах

Вакцина	Белок ГА (мкг в 0,5 мл)	Белок НА/НП (мкг в 0,5 мл)	Белок М (мкг в 0,5 мл)	% вирусного белка от общего белка вакцины
Influvac	33	-	-	61
Agrippal	58	-	-	81
Fluvirin	37	4	-	88
Vaxigrip	45	22	7	80
Begrivac	38	18	1	80
Fluarix	56	27	6	89

ГА - гемагглютинин, НА - нейраминидаза, НП - нуклеопротеин, М - матрикс.

Поскольку молекулярная масса нуклеопротеина и нейраминидазы вируса гриппа практически одинакова, в нередуцирующих гелях они мигрируют совместно, поэтому было невозможно количественно оценить каждый из этих белков в отдельности.

Содержание ГА в проанализированных вакцинах составило от 33 до 58 мкг на дозу (см. табл. 1). Различия в концентрации данного белка были отмечены также между разными партиями одной вакцины (Influvac и Bergivac). Для вакцин Influvac и Agrippal содержание белков НА/НП совпадало с границей измеряемости или было ниже нее. В вакцине Fluvirin низок уровень НА/НП,а уровень матриксного белка ниже границы измеряемости. Пропорция "остальных белков" (немономерного ГА и других примесей) наиболее высока в вакцине Influvac, составляя 39,6% от общего белка, а в вакцине Fluarix содержится наименьшее измеряемое количество яичных протеинов.

В ходе анализа вестерн блоттинг с использованием трех штамм-специфичных антител к ГА во всех проанализированных вакцинах наблюдали положительную реакцию на отдельные ГА обоих подтипов вируса гриппа А и на ГА-белок вируса гриппа В (данные не показаны). Вестерн блоттинг не выявил различий в миграции между тремя молекулами ГА в SDS-PAGE электрофорезе. При использовании антител к тип- и подтипспецифичным ГА сигналы были значительно более выраженными и ясно различимыми.

Пробы антителами к белкам матрикса и нуклеопротеинам не вызвали специфических сигналов в трех субъединичных вакцинах, в то время как в расщепленно-вирусных содержались в различных количествах оба эндогенных белка вируса гриппа (данные не показаны).

Вакцины сильно различались по содержанию яичного альбумина. Наибольшее содержание яичного альбумина (325 нг на дозу 0,5 мл), по результатам метода ELISA, было обнаружено в вакцинах Influvac и Agrippal (35 нг на дозу 0,5 мл) (см. табл. 2). В остальных анализируемых вакцинах содержание яичного альбумина было около 10 нг на дозу 0,5 мл.

Таблица 2. Различия в составе яичного альбумина, эндотоксина и нейраминидазы

Вакцина	Содержание яичного альбумина (в 0,5-мл дозе)	Содержание эндотоксина (в 0,5-мл дозе)	Активность нейраминидазы (в 0,5-мл дозе)
Influvac	325 нг	0,9 EД. ELISA(EU)	1,5 мЕД (mU)
Agrippal	35 нг	<0,5 EД. ELISA(EU)	0,4 мЕД (mU)
Fluvirin	10 нг	4,6 EД. ELISA(EU)	не обнаружено
Vaxigrip	11 нг	64,0 EД. ELISA(EU)	0,5 мЕД (mU)
Begrivac	11 нг	1,0 EД. ELISA(EU)	0,5 мЕД (mU)
Fluarix	10 нг	<0,5 EД. ELISA(EU)	0,5 мЕД (mU)

В вакцинах Fluvirin,Vaxigrip, Begrivac и Fluarix по результатам анализа вестерн блоттинг наблюдалась лишь слабая иммунная реакция на антиаллантоисовые антитела. Реакция, однако, была значительно сильнее в образцах вакцины Influvac, свидетельствуя о высоком уровне примесей яичных протеинов и подтверждая приведенные в табл. 2 результаты анализа ELISA.

Самое высокое содержание эндотоксина зарегистрировано в вакцине Vaxigrip (64 ЕД. ELISA на дозу 0,5 мл). Самые низкие уровни эндотоксина обнаружены в вакцинах Agrippal и Fluarix (<0,5 ЕД. ELISA/0,5 мл) (см. табл. 2).

За исключением Fluvirin все вакцины содержали различные уровни активной нейраминидазы. Наивысшая активность нейраминидазы обнаружена в вакцине Influvac (см. табл. 2). Это доказывает наличие сохранившего биологически функциональную форму второго антигена вирусной мембраны.

Все проанализированные образцы вакцин обладали способностью к гемагглютинации куриных эритроцитов при обычном анализе в микротитровочных налетах. Активность гемагглютинации отдельных вакцин составляла от 1:400 до 1:12800.

Шесть имеющихся на рынке инактивированных вакцин были охарактеризованы при помощи молекулярных и биологических методов. Данные показывают, что биологические характеристики, разнообразие и состав вирусных белков и примесей различны не только для субъединичных и расщепленно-вирусных, но и для разных партий конкретных вакцин.

Окончательный состав вакцины должен отвечать требованиям, предъявляемым организацией, управляющей производством лекарств (European Pharmacopoeia). Требования для субъединичных и расщепленно-вирусных вакцин неодинаковы. Общее содержание белка в расщепленно-вирусных вакцинах не должно превышать 100 мкг белка на один используемый штамм, а общее количество - 300 мкг на дозу. Максимальное содержание белка в субъединичных вакцинах - 80 мкг на один штамм и 240 мкг на дозу. Для субъединичных вакцин European Pharmacopoeia допускает не более 40 мкг иного, чем гемагглютинин, белка на один вирусный штамм, а общее количество не должно превышать 120 мкг на дозу.

Данные требования не нарушены ни в одной из проанализированных вакцин. Общее содержание белка в субъединичных вакциннах было ниже такового в расщепленно-вирусных. Однако, вопреки распространенной точке зрения, это не свидетельствует о повышенной степени очистки субъединичных вакцин. Более высокое общее содержание белка в расщепленных вакцинах объясняется присутствием эндогенных вирусных белков, таких, как матриксные и нуклеопротеины, слабо или вообще не регистрируемых в субъединичных вакцинах.

По результатам сканирования окрашенных Кумасси белковых гелей, самое низкое содержание грипп-специфичных вирусных белков наблюдалось в вакцине Influvac (61% от общего содержания белка). В данной вакцине, по результатам анализа ELISA, самое высокое содержание яичного альбумина. Оно более чем в 20 раз превышает содержание данногобелка в вакцинах Fluvirin, Vaxigrip,Begrivac или Influsplit/Fluarix. Содержание альбумина в вакцине Agrippal приблизительно в 3,5 раза больше, чем в этих четырех препаратах. Вестерн блоттинг подтвердил наиболее выраженную реакцию с антиаллантоисовыми антителами вакцин Influvac и Agrippal.

Хотя в современных противогриппозных вакцинах яичные протеины содержатся лишь в небольших количествах, они могут вызывать немедленные реакции гиперчувствительности у лиц с тяжелой яичной аллергией. Ни в одной из проанализированных вакцин содержание яичного альбумина не превышало максимально допустимых организацией European Pharmacopoeia уровней яичных белков (1 мкг/0,5 мл).

Содержание эндотоксиновых примесей было наиболее высоким в вакцине Vaxigrip (64 ЕД. ELISA/0,5 мл) и наиболее низким - в вакцинах Agrippal и Fluarix. В остальных вакцинах уровни бактериальных эндотоксинов были низки (0,9-4, ЕД. ELISA на дозу 0,5 мл). Все вакцины удовлетворяли стандарту European Pharmacopoeia (100 ЕД. ELISA/0,5 мл).

По данным производителей, в каждой вакцине количество гемагглютининового антигена на один вирусный штамм составляет 15 мкг по результатам теста Single Radial Diffusion (SRD). Сравнение биологических свойств гемагглютинации на эритроцитах показало, что титр гемагглютинации вакцины Fluvirin был в 5-6 раз ниже, чем в других вакцинах. Данный низкий титр не отражает истинное содержание гемагглютининового антигена и не может рассматриваться как признак пониженной иммуногенности. Между 15 мкг ГА, измеренными методом SRD, количеством ГА, определенного сканированием на геле, и титром гемагглютинации отсутствует прямая корреляция. Анализ при помощи электронного микроскопа показывает, что морфология этих антигенов различна независимо от типа вакцины. По сравнению с расщепленными субъединичные вакцины Influvac и Fluvirin продемонстрировали высокие уровни гомогенности иммунологически значимых молекул ГА, имеющих характерную форму розеток. Формирование розеток ГА потенциально приводит к максимальной межмолекулярной доступности для представления эпитопа; однако неизвестно, сохраняются или нет розетки в неизменной форме в течение значимого временного интервала после введения вакцины.

За исключением вакцины Fluvirin, во всех вакцинах обнаружена измеряемая активность нейроминидазы. В требованиях European Pharmacopoeia для субъединичных вакцин активность нейраминидазы не упоминается. Присутствие активной нейраминидазы может рассматриваться как свидетельство аккуратного приготовления вакцин. Способность данного активного фермента вызывать побочные реакции после введения вакцины остается невыясненной.

В отличие от данных, полученных при анализе субъединичных вакцин, белки матрикса и нуклеопротеины вируса гриппа присутствовали в той или иной степени во всех трех расщепленно-вирусных вакцинах (по результатам SDS-PAGE и вестерн блоттинга).

Эффективность проанализированных вакцин, обеспечиваемые ими уровни защиты от клинического заболевания, частота и тяжесть нежелательных поствакцинальных побочных явлений и эпидемиологическая значимость их молекулярных и биохимических свойств могут быть оценены только в клинических испытаниях.