Опубликовано в журнале:
»» № 1/2002

ВАКЦИНЫ И ВАКЦИНАЦИЯ
ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ

Гордон Ада (под редакцией Яна Маккая и Фрэда Розена)

Институт медицинских исследований им. Джона Куртина, Австралийский национальный университет, Канберра, Австралия

Более 70 видов бактерий, вирусов, простейших и грибков являются возбудителями серьезных заболеваний человека [I]. Уже имеются вакцины против некоторых из этих возбудителей, кроме того, ведутся работы по созданию вакцин против почти всех остальных бактерий и вирусов, и против примерно половины простейших. В таблице 1 перечислены инфекции для борьбы с которыми вакцины разрешены к применению или изучались в рамках 3-й фазы клинических испытаний [2], и поэтому, вероятно, будут разрешены в предстоящие 5-10 лет.

Традиционно, ослабленные вакцины производились путем повторных пассажей возбудителя на тканевой культуре или в организме заражаемых животных, до значительного уменьшения вирулентности при сохраненной иммуногенности. Другим способом подрыва инфекционных свойств была обработка химическими веществами, например, формалином. Более новая методика состоит в использовании фрагментов организма возбудителя, обычно поверхностного антигена в качестве вакцины-субъединицы. В настоящее время вакцины против вирусного гепатита В и болезни Лайма производятся на основе рекомбинантной технологии. Бактериальные токсины обезвреживаются химической обработкой, и полученный анатоксин защищает от возбудителя инфекции. Защиту от некоторых типов бактерий, образующих капсулы, удалось достичь иммунизацией капсулярными олиго- или по-лисахаридами, но эти антигены, действие которых не зависит от Т-клеток, индуцируют только антитела IgM, работа которых ненадежна в раннем детском возрасте. А вот если связать такие сахара с белком или белковым комплексом, то индуцируется образование антител IgG, потому что Т-клетки распознают комплекс из пептида и молекулы основной системы гистосовместимости на клетке, подающей антиген. Конъюгатные вакцины против Haemophilus influenzae типа b, помимо прочего, индуцируют иммунитет слизистых оболочек, что сокращает трансназальное поступление бактерий. Такие конъюгаты очень эффективно защищают детей.

Эффективность некоторых вакцин для детей

В базу данных Центра по профилактике и контролю над заболеваниями (Centers for Disease Control and Prevention - CDC) с 1912 вносятся сообщения о числе случаев инфекционных заболеваний до и после внедрения вакцины [4]. При этом отмечено разительное падение числа заболевших: на 1.00% в случае автохтонного полиомиелита (последний случай в Северной и Южной Америке зафиксирован в 1992 году в Перу), более чем на 99% упала частота случаев дифтерии, кори, свинки и краснухи;более чем на 97% - частота коклюша (вызываемого Bordetella pertussis). Все эти возбудители если и имеют генетическую вариабельность (или изменчивость), то она весьма незначительная, что представляет, по существу, идеальные условия для достижения целей вакцинации.

В Великобритании за 1 год после внедрения в 1999 году конъюгатной вакцины против Neisseria meningitidis серогруппы С, частота менингита снизилась на 92% среди детей младших возрастных групп и на 95% среди подростков (13-19 лет) [5]. Конъюгатная вакцина, полученная из Salmonella typhi-Vi (Vi-rEPA) позволила снизить частоту брюшного тифа у детей 2-4 лет более чем на 90% [б]. Оба эти примера показывают чрезвычайную эффективность конъюгатных вакцин.

Поучителен пример кори в Соединенных Штатах. В период 1912-1963 гг. число случаев этого заболевания никогда не опускалось ниже 100 000 в год, и часто отмечались эпидемии. После внедрения первой вакцины в 1963 году заболеваемость снизилась и оставалась на очень низком уровне до 1990, когда началась эпидемия, продолжавшаяся 3 года, с числом заболевших почти 28 000, большинство из них были подростками или молодыми взрослыми, которым в возрасте 1-2 года не проведено адекватной вакцинации. Именно неадекватная вакцинация в крупных городах привела к этому возврату болезни. Понимание того, что иммунитет после вакцинации может быть потерян, привело к проведению двухдозной вакцинации, что воспрепятствовало распространению автохтонной коревой инфекции в Соединенных Штатах, Канаде и в Финляндии.

Иногда вакцинация может потерпеть неудачу, что свидетельствует о недостаточности индуцируемой иммунной реакции. Отсутствие или недостаточность иммунной реакции на простую вакцину, например на вакцину против гепатита В, можно избежать добавлением к вакцине дополнительных эпитопов Т-хелперов [7]. В случае вируса varicellazoster, как и в случае других вирусов, вызывающих латентные инфекции, живая ослабленная вакцина может предотвратить ветрянку, не искоренив вирус из организма.

Безопасность вакцин

Неблагоприятные явления, вызываемые детскими вакцинами, некоторые авторы разделяют на ранние и поздние реакции. К реакциям, развивающимся в первые 24 часа, относятся эритема и отек в месте инъекции, лихорадка, длительный плач, синкопе, судороги и, редко, эпизоды гипотонии, гипореактивность и анафилаксия. В первые несколько недель после вакцинации могут развиваться такие реакции, как энцефалит и энцефалопатия, которые в некоторых случаях приводят к клинически значимому повреждению головного мозга.

Таблица 1. Современное положение с вакцинами против возбудителей некоторых заболеваний человека.

*Ожидается, что вакцины, которые проходят III фазу клинических испытаний, получат разрешение на применение через 5-10 лет, * * ПСПЭ - подострый склерозирующий панэнцефалит.

В 1970-е годы в Великобритании использование цельно-клеточной вакцины против коклюша снизилось примерно на 30% из-за опасений, что эта вакцина вызывала повреждение головного мозга. Две последующие вспышки коклюша явились причиной более 30 смертей, и у многих инфицированных детей отмечалось повреждение головного мозга [8]. При разборе конкретных случаев не удалось доказать наличие связи между вакциной и повреждением головного мозга.

Случаи побочных эффектов вакцин могут фиксироваться лишь при условии, если вакцина прошла лицензирование. Именно так и было в случае вакцины против ротавирусной инфекции в Соединенных Штатах, которая недопустимо часто вызывала инвагинацию [9]. Демиелинизирующая энцефалопатия отмечается примерно в одном из миллиона случаев применения вакцины против кори, а частота этого осложнения после инфекции натуральной кори составляет 1 на 1000 [10]. Частота подострого склерозирующего энцефалита, в развитии которого прямо участвует вирус кори, сократилась, по меньшей мере, на 90% вслед за широким распространением вакцинации. Синдром Guillain-Barre развивается примерно у одного из миллиона реципиентов вакцины против гриппа.

Пероральная вакцина против полиомиелита искоренила это заболевание в Северной и Южной Америке, но вакцина вызывала паралич у реципиента или у лица, непосредственно контактировавшего с ним, с частотой 1 случай на миллион доз вакцины, как результат повторного появления вирулентности у 3-го типа того штамма вируса, применявшегося для производства вакцины. Консультативным советом CDC по практике иммунизации и Американской академией педиатрии издана рекомендация по использованию только инактивированной вакцины против полиомиелита после 1 января 2000 г. [II].

В общем, нет твердых теоретических или клинических доказательств того, что введение какой-либо вакцины вызывает специфическую аллергию, астму, аутизм, рассеянный склероз или синдром внезапной смерти младенцев. В широко цитируемом сообщении [12] заявлялось о связи между вакцинацией против кори (обычно проводимой с помощью вакцины корь-свинка-краснуха) и последующим развитием воспалительного заболевания толстой кишки или аутизма. Однако, по меньшей мере, 10 последующих исследований не выявили данных в пользу такой связи.

Глобальное обеспечение вакцинами

Для успеха программы искоренения болезни с помощью вакцины требуется наличие 4-х условий: инфекция должна поражать только людей, не должно быть резервуара среди животных; в случае вирусных инфекций должно быть минимальное число разных его штаммов в сочетании с устойчивостью антигенных свойств; вирус не должен персистировать в пораженном организме; должна быть в наличии эффективная вакцина. В 1966 году оценочное число случаев натуральной оспы во всем мире составляло 20 миллионов. Последний эндемический случай натуральной оспы отмечен в 1977 году, а в 1980 году объявлено об искоренении этого заболевания [15]. Полиомиелит стал следующей мишенью для ликвидации, которую планировалось осуществить с помощью пероральной вакцины полиомиелита. Эта задача оказалась более трудной, из-за термолабильности вакцины, необходимости применения нескольких доз, вероятности (хотя и очень малой), что вакцина может сама вызвать паралич, и, кроме того, в отличие от натуральной оспы, нет простого теста, указывающего на успешность вакцинации. Автохтонный полиомиелит уже ликвидирован в Северной и в Южной Америке, в Европе, в западной части Тихоокеанского региона и в Юго-Восточной Азии, но понадобится еще несколько лет, чтобы добиться ликвидации этой болезни в глобальном масштабе [16].

Корь обладает самой высокой контагиозностью среди инфекций человека, и она вызывает 30% от общего числа смертей в результате заболеваний, которые можно предотвратить вакцинацией. В странах с очень высоким охватом вакцинации против кори (а именно, в Северной и в Южной Америке) удается прерывать распространение этой инфекции, что является шагом на пути ликвидации кори.

Расширенная Программа иммунизации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) увеличила охват населения вакцинацией против столбняка, дифтерии, коклюша, туберкулеза, кори и полиомиелита в развивающихся странах с 5% в 1974 году до среднего уровня в 80% к началу 1980 годов, с тех пор частота вакцинаций сохраняется примерно на том же уровне. Новая влиятельная группа "Глобальный альянс в поддержку вакцинации и иммунизации" имеет следующие цели: искоренить полиомиелит, повысить уровень вакцинированности детей до 90% во всем мире, включив при этом в обязательный список вакцину против гепатита В и вакцину против Н. Influenzae типа b [17].

В отчете ВОЗ "Здоровье мира в 1998 году" [18] отмечается, что за 1 год фиксируется около 5 миллиардов случаев заболеваний, причем 6-7 миллионов человек умирают от детской диареи, вызываемой, в числе прочих возбудителей, ротавирусами [19], или от острой инфекции дыхательных путей, особенно если в качестве возбудителя выступает респираторный синтициальный вирус [2]. Инфекции, вызываемые 1-м типом вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), туберкулез и малярия приводят к смерти 7-8 миллионов человек ежегодно, главным образом, в развивающихся странах. В этих странах неуклонно растет частота заболеваний, передающихся половым путем [20]. Вакцинация предоставляет наиболее реальный шанс уменьшить эти страшные потери. Основная задача при практическом применении вакцин заключается в индуцировании мощной реакции в виде образования антител, способных помешать развитию инфекционного заболевания, но в отношении многих распространенных заболеваний до сих пор не удалось создать вакцины такого традиционного типа. Очень нужны новые вакцины, которые не просто обладали бы большей силой, но индуцировали, преимущественно, гуморальную или клеточно-опосредованную иммунную реакцию.

Иммунные реакции и сдерживание инфекций

Имеется 2 типа развития инфекций. Все вирусы, некоторые бактерии и простейшие являются облигатными внутриклеточными организмами, которые могут жить и размножаться только внутри клеток. Другие виды бактерий и простейших живут и размножаются внеклеточно. Кроме того, инфекции бывают острыми, либо персистирующими. Инфекция считается острой, если сублетальная доза возбудителя сдерживается и быстро устраняется иммунной системой; большинство современных вакцин направлено против таких инфекций. Инфекция становится персистирующей в тех случаях, когда возбудителю удается избежать контакта с элементами иммунной системы или разрушить их.

Функция различных классов антител - IgM, IgE, IgA и подклассов IgG в борьбе организма с инфекцией состоит в предотвращении или ограничении начальной инфекции и последующей виремии или бактериемии, а также в умерщвлении инфицированных клеток через клеточную цитотоксичность, зависящую от наличия антител, или через комплемент-опосредованный лизис [21]. В случае внеклеточной инфекции, специфическому антителу требуется мощная поддержка Т-лифоцитами-хелперами 1-го типа CD4+ (Тh1).

При внутриклеточных инфекциях образованию антимикробных антител в достаточной концентрации должны предшествовать ключевые события с участием Т-клеток. Снижение числа возбудителей совпадает с повышением активности цитотоксических Т-клеток [22]. Например, у людей, инфицированных ВИЧ-1, снижение содержания вируса-возбудителя в крови происходит при появлении вирус-специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов, -задолго до прихода нейтрализирующих антилел [23, 24]. Данные эффекторные Т-клетки ответственны, прежде всего, за сдерживание и, в некоторых случаях, за устранение различных внутриклеточных инфекций, что детально описано на примере многих заболеваний.

Цитотоксические Т-клетки CD8+, с функцией, ограниченной I классом антигенов

Ввиду того, что в клетках всех типов, за исключением гамет, нейронов, эритроцитов и трофобластов, имеет место экспрессия антигенов класса I из системы МНС, большинство клеток могут быть распознаны Т-лимфоцитами. Инфицированные клетки меняются так, что их могут лизировать цитотоксические Т-клетки гораздо раньше выделения вирусных тел, тем самым эффекторные Т-клетки имеют время, чтобы найти и разрушить инфицированные клетки до начала прогении. Кроме прямого участия в сдерживании инфекции путем уничтожения ин фицированных клеток, цитотоксические клетки се-кретируют мощные цитокины, которые обладают противовирусным действием и активируют макрофаги. Примерами таких цитокинов являются ин-терферон у и фактор некроза опухолей а.

Есть четыре группы людей, инфицированных ВИЧ-1, и не получавших противовирусное лечение, у которых анализы на наличие вируса и антител против него отрицательны, но при этом у них обнаруживаются CD8+ цитотоксичные Т-клетки, специфичные в отношении ВИЧ-1, либо у-интер-ферон, вырабатываемый такими клетками: это малыши, родившиеся от инфицированных матерей [25, 26]; лица, длительно поддерживающие половую связь с инфицированными [27, 28]; женщины-африканки, долго занимающиеся проституцией [29]; некоторые работники здравоохранения, с однократным попаданием вируса в организм [30]. Кстати, интересно, что введение обезьянам высокоактивной сыворотки против CD8 до и вскоре после их инфицирования вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) вызывало значительное транзиент-ное повышение числа вирусов [31-33] и уменьшение числа Т-клеток типа CD-8 [31].

Регионарный иммунитет

Общая площадь слизистых оболочек значительно превышает площадь поверхности кожи. Слизистые имеют тыл в виде развитой системы лимфатических коллекторов. Исключением является влагалище, нормальная флора которого включает порядка шести разных видов бактерий, поддерживающих среду, неблагоприятную для колонизации другими бактериями. Имеется единая для организма система слизистых, поэтому иммунизация в одной зоне этой системы может обеспечить защиту для другой зоны. Так, вакцина против аденовирусов принимается внутрь, но защищает против инфекций дыхательных путей [34]. У мышей и обезьян иммунизация через дыхательные пути является эффективным способом вызвать сильную иммунную реакцию со стороны полового тракта [35], и этот факт может быть использован при разработке вакцин против заболеваний, передающихся половым путем. Попадание на слизистую возбудителей инфекции или вакцины не только вызывает выработку секреторных IgA, но, кроме того, может стимулировать миграцию цитотоксических Т-клеток в данный очаг. Например, специфические цитотоксические Т-клетки обнаруживаются в материале для цитологического исследования, взятого щеточкой с шейки матки некоторых женщин, инфицированных ВИЧ-1 [36].

Как внутриклеточные инфекции обходят, подавляют и сводят на нет иммунные реакции

Микробы сводят действие гуморального иммунитета на нет, главным образом, с помощью варьирования последовательностей поверхностных антигенов [37]. Другие тактики заключаются в заведомо слабой иммуногенности и в закрытости эпитопов, по которым поверхностные антигены распознаются нейтрализующими антителами и которые связываются с антителами с образованием комплекса микроб-антитело, что повышает вероятность появления инфицированных клеток, например, макрофагов, с экспрессией рецепторов к Fc или комплементу. ВИЧ-1 применяет все три перечисленные тактики [38].

Инфекция обычно становится персистирующей тогда, когда клеточно-опосредованная реакция подавляется или прекращается. ВИЧ-1 использует целый арсенал механизмов [38]: латентная инфекция;развитие инфекции в местах, недоступных действию иммунных реакций; разрушение Т-клеток типа CD-4+; подавление экспрессии молекул класса I системы МНС; мутации, меняющие последовательности в вирусных пептидах и делающие, тем самым, эффекторные Т-клетки неэффективными; ингибирование активности цитотоксических Т-клеток. Создание вакцины, побеждающей поползновения ВИЧ-1, будет нелегким, но существующие трудности можно преодолеть принципиально новыми вакцинными технологиями.

Новые подходы к вакцинации

Получение антигенов и антител в трансгенных растениях

Существуют способы производства вирусных и бактериальных антигенов с помощью трансгенных растений [39, 40]. Поверхностный антиген вируса гепатита В, энтеротоксин кишечной палочки и гликопротеин вируса бешенства, выработанные трансгенными растениями, индуцируют синтез антител IgG с адекватной антигенной специфичностью после перорального введения мышам. Например, у мышей, которых покормили картофельными клубнями с одним или несколькими чужеродными антигенами, появлялись мукозные IgA и сывороточные IgG, специфичные в отношении данных антигенов. У свиней, накормленных трансгенным картофелем с экспрессией защитного белка, специфичного для вируса инфекционного гастроэнтерита, отмечалось существенное сокращение заболеваемости и смертности при контакте с этой инфекцией. Такой подход обладает потенциальными преимуществами, такими как низкая стоимость и возможность проведения вакцинации простым принятием в пищу той части трансгенного растения, которой человек отдаст предпочтение.

Помимо вакцинных антигенов, в растениях удалось синтезировать специфические антитела ("фитоте-ла"). Антитело против Streptococcus mutans, участвующего в развитии кариеса зубов, вводилось в специально обработанную полость рта у добровольцев, тем самым обеспечивалась защита от реколонизации этим микробом на 4 месяца [41]. К настоящему времени получено много таких антител [42].

Чрескожная иммунизация

Чрескожная иммунизация подразумевает нанесение антигена вместе с адъювантным токсином (часто это холерный токсин) на интактную кожу, предварительно вымытую для облегчения пенетрации [43]. У мышей активные вещества проникают в эпидермис, где они входят в контакт с клетками Лангерганса (разновидность дендритных клеток) и захватываются ими. Затем эти клетки мигрируют через дерму по афферентным лимфатическим сосудам и попадают в регионарные лимфатические узлы, на этом пути дендритные клетки созревают и приобретают способность эффективно представлять антигены иммунной системе. В лимфатическом узле они контактируют с Т-клетками и активируют их, таким образом запуская мощную реакцию с участием антител в ответ на такие антигены, как дифтерийный анатоксин.

Производство вакцин

Пептиды, субъединицы и адъюванты

Применение пептидов, которые являются лишь частями антигенов, имеет многие преимущества, но не лишена недостатков [1]. К преимуществам относится наше знание о химическом составе продукта, кроме того, такой продукт стабилен, безопасен и содержит только важные эпитопы, реагирующие в Т-и В-лимфоцитами. Слабые стороны данного подхода связаны со следующими обстоятельствами: трудность воспроизведения конформаиии антигенных полимеров, которая характерна для многих вирусов; некоторые эпитопы В-клеток, распознаваемые нейтрализующими антителами, на самом деле, иногда состоят из несвязанных друг с другом фрагментов; пептиды легко подвергаются протеолизу. Может потребоваться несколько введений, обычно с адъювантом. Конъюгация пептидного эпитопа с белком-носителем, например, с анатоксином, может улучшить выработку антител. Первая простая пептидная вакцина, составленная из последовательностей протеинов малярийного плазмодия, дала разочаровывающие результаты у маленьких детей в странах, где малярия эндемична [44]. Эпитопы цитотоксических Т-клеток (которые обычно являются нонамерами) могут связываться с молекулами класса I системы МНС, располагающимися на поверхности дендритных клеток. Ввиду того, что дендритные клетки могут, помимо прочего, экс-прессировать костимулирующие молекулы, эти клетки могут непосредственно взаимодействовать с Т-клетками типа CD-8+ и активировать их. Данный механизм применяется в настоящее время в иммунотерапии рака, как описано ниже.

Субъединичные вакцины нередко вырабатываются с применением рекомбинантной ДНК. Иммуногенность может быть усилена, и иммунная реакция направлена на индуцирование как клеточно-опосредованного, так и гуморального реагирования, с помощью агрегатов (вырабатываемых в разных условиях), таких как иммуностимулирующие комплексы, вирусоподобные частицы, носители с антигенным покрытием и антигены в липидной капсуле [45-48]. В настоящее время испытываются и агрегаты соединенных пептидов. Так, проводятся клинические испытания вакцины против ревматизма, представляющей собой полимерный препарат соединенных пептидов из стрептококков группы А [49]. Испытывается и полимер из плазмодийных пептидов, в который добавлен липопептид для стимуляции взаимодействия между клетками, тем самым намереваются вызвать мощную иммунную реакцию против малярии [50].

Вакцины самых простых типов нередко вводятся с адъювантными веществами для усиления иммуногенности. В качестве адъювантных веществ чаще всего применяются квасцы, которые замедляют высвобождение антигена, например, при вакцинации против гепатита В, и стимулируют образование антител. Список других веществ, используемых с этой целью, очень широк. Некоторые из них в настоящее время проходят клинические испытания [51]. В ходе первой фазы клинических испытаний вакцины против малярии показано, что квасцы и QS21 значительно увеличивали выработку антител [52].

Живые вакцины как векторы антигенов других вакцин

Высок интерес к применению вакцин, в состав которых входят ослабленные вирусы или бактерии, выступающие в качестве носителей (векторов) иных антигенов [53]. В 1982 году была впервые описана методика встраивания ДНК, кодирующей антиген другого возбудителя, в вирус вакцины [54, 55]. При инфицировании химерным вирусом вакцины, в клеточных культурах, а также в организме подопытного животного происходила экспрессия чужеродной ДНК, и при этом животное получало защиту от инфекции, вызываемой микробом-источником данной ДНК.

Экспериментально в качестве векторов используется более 20 различных ДНК-вирусов, РНК-вирусов и бактерий. Наиболее часто используются вирусы вакцины, особенно значительно ослабленный штамм Анкара, а также вирусы fowlpox и саnаryрох, которые инфицируют клетки человека но не размножаются в них [56, 57]. Примерно 10% большого генома поксвирусов может быть заменено чужеродной ДНК, следовательно, эти векторы могут послужить для создания поливалентной вакцины. Аденовирус и Sal. typhi могут быть использованы в качестве векторов, если целью является реакция со стороны слизистых [58].

Данный подход получил новое измерение, благодаря тому, что удалось встроить ДНК, кодирующую интерлейкин-2, в химерный поксвирусный вектор [59, 60]. Цитокины, применяемые таким способом, позволяют направлять иммунную реакцию преимущественно в сторону гуморальной или в сторону клеточной иммунной реакции. Однако, у этого подхода, вероятно, имеются недостатки. Инфицирова-ние вирусом mousepox (вирус ectromelia) с экспрессией интелейкина-4 приводило к высокой смертности среди мышей, генетически устойчивых к вирусу ectromelia. Даже если эти мыши были предварительно иммунизированы, у них сохранялась значительная смертность от инфицирования вирусом ectromelia с экспрессией интерлейкина-4.

ДНК-иммунизация

Интересно, что ДНК, которая кодирует чужеродные антигены, может быть встроена с подходящим промотером в бактериальный плазмид. Внутримышечное введение этого комплекса подопытной мыши вызывает у нее иммунную реакцию против антигена, кодируемого данной ДНК. Кстати, реакция эта очень сильна, так как бактериальная ДНК, в от
личие от ДНК позвоночных, оценивается позвоночными как чужеродная, благодаря высокому содержанию в ней неметилированных фрагментов CpG [62, 63], а именно, фрагмент GACGTT распознается мышью, a GTCGTT - человеком. Такие фрагменты, распознанные белком млекопитающего (колоколобразный рецептор 9) [64], который экс-прессируется различными клетками врожденной иммунной системы, стимулируют образование, активацию и созревание дендритных клеток. Эти клетки, в свою очередь, индуцируют, преимущественно, Тh1-реакцию, благодаря которой сдерживается немало внутриклеточных бактериальных инфекций. Препараты с фрагментами CpG эффективны и при нанесении на слизистую. В настоящее время активно проводятся клинические испытания подобных вакцин [62].

Еще один вариант технологии состоит в том, что берется небольшое число плазмид, помещается на крошечные частички-носители, которые выстреливаются "генетической пушкой", пробивающей кожу. Некоторые из таких частиц проникают прямо в дендритные (Лангергансовы) клетки, очевидно, обходя колоколообразные рецепторы типа 9 и индуцируют у мышей реакцию с уклоном в сторону активации Т-хелперов типа 2 (Th2), что ведет к активации образования антител. А вот у обезьян, если сначала запустить иммунную реакцию с помощью ДНК, введенной посредством генетической пушки, а потом усилить эту реакцию введением живого химерного вектора, то в итоге получится сильная Тh1 реакция [56, 57].

Данный подход имеет множество потенциальных преимуществ, таких как: низкая стоимость, стабильность и отсутствие инфекционных свойств (хотя иммунная реакция напоминает таковую при естественной инфекции), а также тот факт, что присутствие антител против антигена, экспрессируемого ДНК, не ослабляет иммунного ответа. Среди возможных недостатков - интеграция вводимой ДНК в геном организма-хозяина, что может привести к трансформации или туморогенезу, а также к образованию антител против ДНК. Однако, такие неблагоприятные события еще не отмечались.

Последовательная иммунизация

Традиционно, иммунизацию повторяют, и каждый раз при этом вводится один и тот же препарат. Однако, когда мышей иммунизировали препаратом химерной ДНК, а потом для стимуляции ответа вводили химерный вирус fowlpox, экспрессирующий тот же антиген (гемагглютинин гриппа), то титры антител против гемагглютинина были примерно в 50 раз больше, чем после 2-х инъекций препарата ДНК [65]. Обоснованность такого подхода (инициирование, затем усиление) была подтверждена, а его применение в последствии расширено. Если введением ДНК инициировать иммунную реакцию на Т-клеточные эпитопы из ВИЧ-1 антигенов [66] или из спорозоитов плазмодиев [67], а затем усилить эту реакцию путем введения значительно ослабленного вируса вакцины (штамм Анкара) (на обоих этапах используются антигенные свойства одних и тех же эпитопов), то достигаются очень высокие уровни цитотоксических Т-клеток типа CD8+ у мышей [68] или у обезьян в случае ВИЧ-1 [69]. При этом в эксперименте с малярией мыши были полностью защищены от атаки плазмодиев (Plasmodium berghei). Если же иммунную реакцию старались инициировать введением химерного поксвируса, и усиливать введением ДНК, то эффект был весьма мал.

У обезьян, иммунизированных против ВИЧ-1 или SIV-1 (согласно протоколу: специфическая химерная ДНК —> вирус fowlpox), отмечалась сильная клеточно-опосредованная реакция, реакция же со стороны гуморального иммунитета была ниже уровня защиты, а, в результате, эти обезьяны оказались защищенными от инфекции, когда им вводили ВИЧ-1 [56] или патогенный SIV [57]. Аналогично, у обезьян, иммунизированных по протоколу SIV-специфическая ДНК —> штамм Анкара (вирус вакцины), были защищены от персистирующей инфекции при инфицировании через слизистую [70].

В других успешных экспериментах на обезьянах химерный аденовирус был использован как усилитель иммунизации после первоначального введения частиц с ДНК [71]. Аналогично, у обезьян, иммунизированных ДНК-частицами, получавших затем фузионный интерлейкин-2-иммуноглобулин как усилитель, была достигнута защита против высокопатогенного SIV [72]. В настоящее время ведутся клинические исследования, призванные установить, вызывают ли такие ДНК-поксвирусные протоколы сильную реакцию со стороны Т-цитотоксических клеток, как долго сохраняется иммунитет, уменьшается или нет передача вируса и достигается ли долговременная защита от развития синдрома приобретенного иммунодефицита у лиц с повышенным риском. Результаты этих исследований дают веское основание для следующей тактики: недавно инфицированных ВИЧ сначала лечить противо-ретровирусными лекарствами, а когда титр вирусов снизится до минимума, провести вакцинацию, чтобы вызвать длительный сильный клеточный иммунитет [73]. Этот подход может на долгое время избавить пациентов от необходимости получать лекарственное лечение.

Аналогичный подход дает надежду на сдерживание инфекции, вызываемой вирусом Эбола. Обезьяны, иммунизированные химерной ДНК и последующим химерным аденовирусом (с введением на каждом этапе ДНК, кодирующей антигены вируса Эбола), оказались защищенными даже от таких количеств вируса Эбола, которые в обычных условиях являются летальными [58]. Ободряющие результаты были получены и при использовании подхода инициирование —> усиление для защиты мышей от туберкулеза[74].

Будущее вакцинации

Инфекционные заболевания

Практика срочно требует создания вакцин против целого ряда вирусов. Однако, наибольшую угрозу людям представляют ВИЧ-1 и видоизмененный вирус гриппа А [75]. В случае как ВИЧ-1 [76], так и вируса гриппа [77] еще остается надежда получить иммунную реакцию в виде выработки антител с широкой активностью. Но нельзя забывать и о варианте протокола инициирование —> усиление, который, будучи применен для вакцинации против ВИЧ-1, малярии и вирусной лихорадки Эбола, дает длительный Т-клеточный цитотоксический иммунитет, в частности, против ВИЧ-1 у человека. Следовательно, методика инициирование —> усиление может быть применена против многих других вирусов, например, против пандемических вирусов гриппа.

В настоящее время известны полные ДНК-последовательности для многих бактерий, в том числе, для Mycobacterium tuberculosis и Chlamydia tra-chomatis, а для Leishmania major и Plasmodium falci-parum эти последовательности расшифровываются в настоящее время [78]. Знание этих последовательностей позволит составить каталог генов, кодирующих каждый фактор вирулентности и все возможные иммуногены. Тем самым, мы будем знать какова структура мишеней для нейтрализующих антител, а также каковы Т-клеточные эпитопы, взаимодействующие с распространенными аллелями класса I и I I системы аллелей HLA. Например, стало известно, что в некоторых бактериях кодируется ДНК-аденин-метилаза. Сальмонеллы, лишенные этого гена, гораздо менее вирулентны, но при этом вызывают сильную иммунную реакцию.

Неинфекционные заболевания

Аутошшунные болезни

Заболевания, имеющие аутоиммунную этиологию, широко распространены и часто имеют тяжелое течение. Отсюда - интерес к "отрицательным" формам вакцинации, цель которых предотвратить или ослабить иммунную реакцию. В экспериментах, воспроизводящих аутоиммунные заболевания на животных, этот подход предотвратил развитие некоторых типов аутоиммунной патологии [80]. Проведены клинические испытания, в ходе которых изучалось нанесение на слизистую следующих веществ: миелина при рассеянном склерозе, коллагена второго типа при ревматоидном артрите, рети-нального антигена при увейте и инсулина при диабете I типа. Результаты таких исследований были чаще всего, разочаровывающими, лишь некоторые данные можно расценить как неоднозначные [81]. Выходом из создавшейся ситуации может быть выявление людей с высоким генетическим риском или находящихся на самой ранней фазе аутоим-мунного заболевания, когда более реально достижение толерантности.

Рак

С точки зрения вакцинации, имеется два типа злокачественных болезней. Один тип связан с вирусной инфекцией, примерами таких опухолей являются (в скобках указаны вирусы, играющие роль в развитии опухолей, - прим. перев.): первичная ге-патоцеллюлярная карцинома (вирус гепатита В); саркома Капоши (вирус герпеса); В-клеточная лимфома (ВИЧ-1); раковые опухоли полового тракта и плоскоклеточный рак (вирус папилломы); лимфома Беркитта и назофарингеальный рак (вирус Эпштейна-Барра); Т-клеточный лейкоз взрослых (Т-лимфотропные вирусы I и II типов). Другой вид злокачественных болезней, поддающихся воздействию вакцин, - это спонтанные опухоли, в которых происходит экспрессия эндогенных опухолевых антигенов, например - меланома.

При опухолях первого типа вакцинация против соответствующего вируса должна воспрепятствовать туморогeнезу. Получены весьма обнадеживающие данные в отношении вируса гепатита В и первичной гепатоцеллюлярной карциномы. Вакцинация маленьких детей против гепатита В на Тайване сократила частоту первичной гепатоцеллюлярной карциномы по достижении возраста 6-14 лет на 50%, а смертность от этой опухоли упала на 70% [82]. В другом исследовании однократно давалась доза, содержавшая вирусоподобные частицы, содержавшие антиген L-1 штаммов 6 и 11 вируса папилломы, что вызвало мощную иммунную реакцию с участием антител, и отмечалась полная регрессия гениталь-ных бородавок у 22 из 33 пациентов [83]. В настоящее время в США проводятся испытания вакцин против белка Е7, характерного для различных папилломавирусов, вызывающих рак шейки матки.

Иммунотерапия против уже развившейся опухоли - это более сложная задача, но и здесь имеются основания для оптимизма. В меланомах выявлено много опухолевых антигенов. В нескольких небольших клинических исследованиях стимулировалась выработка цитотоксических Т-лимфоцитов, специфических в отношении таких антигенов, при этом примерно у 30% больных отмечалась полная или частичная ремиссия меланомы [84, 85]. Теперь стоит задача повысить эту частоту. Следует искать различные способы запуска достаточно сильной и продолжительной иммунной реакции с участием цитотоксических Т-клеток против нескольких опухолевых антигенов. Многообещающей представляется вакцинация дендритными клетками, полученными от больного и нагруженными материалом из убитой аллогенной меланомы [86]. Женщины, позитивные по HLA-A2 и страдающие раком молочной железы с избыточной экспрессией HER-2/neu, иммунизировались антиген-специфичным полипептидом, содержавшим эпитопы из Т-клеток типов CD4+ и SD8+ с соответствующей HLA-специфич-ностью, - при этом возникала долговременная реакция Т-клеток этих типов, последние были способны лизировать опухолевые клетки [87].

Болезнь Альцгеймера

Образование мутантного белка с небольшими молекулами - амилоидного B-пептида (АB₄₂) - приводит к развитию болезни Альцгеймера. Накопление этого белка в форме нейротоксических бляшек в головном мозге людей, страдающих болезнью Альцгеймера, приводит к потере умственных способностей. Трансгенная мышь, в организме которой происходит экспрессия ДНК, кодирующей АB₄₂, является отличной моделью, причем у этих мышей имеются бляшки в головном мозге и многие аномалии на клеточном уровне, характерные для болезни Альцгеймера. Ранняя иммунизация этих мышей амилоидом B предотвращает образование бляшек и последующие повреждения клеток. Что более удивительно, многие клеточные повреждения исчезали, если вакцина вводилась уже после образования бляшек [88]. В других исследованиях было показано, что если вакцину вводить до формирования бляшек, то удавалось избежать потери памяти, которая была бы неизбежной, не будь вакцинации [89]. Длительное назальное введение указанного белка мышам также приводило к синтезу противовоспалительных цитокинов в головном мозге и к образованию антител [90]. Эти результаты подтверждают представление о том, что накопление амилоида (3 является причиной деменции при болезни Альцгеймера[91,92].

С помощью высокочувствительного мультифотон-ного микроскопа, исследователи наблюдали бляшки в виде плотных скоплений в головном мозге у живых трансгенных мышей, - впервые такие бляшки удалось осмотреть in vivo [93]. Это удалось сделать следующим образом: сначала моноклональное антитело, специфичное в отношении амилоида (3, метилось флюоресцеином, и затем вводилось in vivo в кору. Тем самым, выявлялись множественные отложения амилоида р. Три дня спустя, за счет мобилизации микроглии, большинство бляшек исчезло. Данные упомянутых исследований вселяют надежду на то, что сочетание вакцинации пептидом B-амилоида и иммунотерапии человеческим моно-клональным антителом может уменьшить, и, возможно, даже вызвать регрессию нарушений, вызванных болезнью Альцгеймера.

Выводы

К числу величайших достижений общественного здравоохранения в XX веке относится успех многих вакцин, особенно тех, которые применяются в детском возрасте, и их отменная безопасность, а также ликвидация оспы. Но существует много серьезных болезней, вызываемых микробами, которые обходят или подавляют специфические реакции гуморального и клеточного иммунитета. Иммунизация по методике инициирование —> усиление (при этом обычно сначала вводится ДНК, затем химерный живой вирусный вектор) вызывала сильную цитотоксическую Т-клеточную реакцию, которая предотвращала персистирование инфекции у мышей и обезьян после введения в них ВИЧ-1 и других возбудителей опасных инфекций человека, таких как вирус Эбола и малярийный плазмодий. Успех текущих клинических испытаний вакцинации против ВИЧ-1 с применением этого протокола будет означать смену парадигм на пути прогресса вакцинации. Большим шагом вперед является и расшифровка последовательностей генома многих бактерий. Кроме того, наши горизонты раздвигаются начинаниями по использованию вакцинации и иммунотерапевтических методик для борьбы против неинфекционных болезней, особенно против рака и болезни Альцгеймера. Достижения XXI века могут оказаться не менее впечатляющими, чем достижения века XX.