Опубликовано в журнале:
»» №5-6 1998

Дифтерия: вакцинация, современные методы лабораторной диагностики

Дифтерия - острое инфекционное заболевание, для которого характерно тяжелое течение. Некоторые случаи завершаются летальным исходом. Болеют дифтерией и взрослые, и дети. Вызывает заболевание микроб Corynebacterium diphtheriae, который продуцирует токсин, повреждающий клетки тканей человека. Токсин в значительной степени определяет характер заболевания. Болезнь передается от человека к человеку воздушно-капельным путем. Циркуляция микроба возрастает или, напротив, уменьшается в зависимости от восприимчивости людей к возбудителю. В свою очередь, восприимчивость или невосприимчивость зависит от того, были ли люди привиты специальной вакциной или нет, есть ли у них в крови специфические антитоксические антитела. Поэтому главным методом борьбы с дифтерией является иммунизация детей, а при необходимости и взрослых.

Для иммунизации используют комплексную адсорбированную вакцину, включающую в себя инактивированные (то есть лишенные токсического действия) корпускулярные антигены - возбудители коклюша, инактивированные дифтерийный и столбнячный токсин. Это АКДС или АДС (без коклюшного компонента) вакцины. Цикл иммунизации состоит из первичной вакцинации и ряда ревакцинаций с определенными интервалами времени. Входящий в состав вакцины инактивированный формалином дифтерийный токсин (анатоксин) в отличие от биологически активного токсина не вызывает в организме человека токсического действия, но вместе с тем способствует синтезу специфических антитоксических тел, которые нейтрализуют токсин, выделяемый попавшими в организм бактериями, и предупреждают развитие заболевания или облегчают его течение. В настоящее время ведутся исследования по усовершенствованию вакцин. В частности, показано, что в вакцину целесообразно включить не только анатоксин, но и некоторые компоненты самого микроба, чтобы в организме привитого синтезировались антитела, способные блокировать не только токсин, но и сам микроб.

Помимо иммунопрофилактики (вакцинации) для предупреждения распространения заболеваемости дифтерией важными мерами являются своевременная диагностика заболевания, изоляция больных и бактерионосителей. У привитых лиц дифтерия может протекать в легкой форме или вообще скрыто, в виде бактерионосительства, без явных признаков заболевания. Такие лица, не будучи своевременно изолированными, могут стать распространителями болезни. Вот почему после длительного отсутствия в коллективе или при приеме в детский коллектив, а также при выписке из больницы и детей, и взрослых проверяют на бактерионосительство. Берут пробы из носа и зева и исследуют их на наличие токсигенных бактерий. Такой анализ довольно продолжителен: ориентировочный ответ - через 24 часа, окончательный - через 48 часов и более. Это несколько снижает его ценность, особенно в тех случаях, когда речь идет о диагностике заболевания, когда нельзя медлить с началом специфического лечения с введением антитоксической сыворотки, чтобы предотвратить тяжелые последствия.

Вот почему в лаборатории клеточных гибридов НИИ вакцинаций и сывороток имени И.И. Мечникова РАМН (заведующий В.В. Свиридов) был разработан и апробирован на практике экспресс-метод выявления токсичных микробов. Суть его состоит в том, что взятые из зева и носа пробы помещают в жидкую питательную среду и культивируют в течение 6-8 часов. Затем жидкость исследуют на наличие дифтерийного токсина методом иммуноферментного анализа (ИФА). Такой способ высокочувствителен (выявляется 4 нанограмм токсина в 1 мл и более), специфичен, прост, демонстративен и быстр - ответ о наличии токсичного дифтерийного микроба дается через 17-20 часов. В лаборатории получены моноклональные антитела к той части токсина, которая ответственна за связь с клетками тканей и последующее его токсическое действие. Для постановки ИФА используют специальные планшеты с лунками, к поверхности которых прочно прикреплены данные антитела. В эти лунки вносят испытуемые пробы, и если в пробе есть токсин, он прочно связывается с антителами на поверхности планшета. Далее присутствие токсина выявляется с помощью специфических реагентов, дающих цветную реакцию. Интенсивность окраски меняется в зависимости от количества токсина, связавшегося с антителами. Это позволяет давать ответ не только о наличии токсигенных штаммов, но и о степени их токсичности.

Для клиники и эпидемиологической практики важно не только быстро поставить диагноз заболевания. Также важно иметь возможность количественно оценить напряженность иммунитета у отдельного человека или у больших коллективов. В первом случае это позволяет прогнозировать тяжесть течения и исход заболевания, во втором - оценить эффективность вакцинации и определить степень защищенности населения от заболевания. Наиболее распространенным методом является реакция пассивной агглютинации (РПГА). Этот метод основан на том, что в реакции используют эритроциты, на поверхности которых прикреплен анатоксин. При смешивании взвеси таких эритроцитов с испытуемой сывороткой и последующей инкубации на поверхности лунки образуется осадок эритроцитов в виде зонтика, если антитела есть, если же нет - эритроциты оседают в виде точечного плотного осадка. Для постановки такой реакции не требуется сложного оборудования и реактивов, она доступна любой лаборатории. Однако установлено, что эта реакция малочувствительна и часто дает ложно-отрицательные результаты.

Более точные данные о содержании антитоксических антител получают при постановке реакции нейтрализации токсина антителами. Она может быть поставлена на животных (этот метод используется в настоящее время для стандартизации диагностических и лечебных антитоксических сывороток, но он малопригоден для испытания сывороток, полученных от человека) или в культуре прививаемых клеток. К дифтерийному токсину чувствительны многие культуры клеток: Vero - культура клеток обезьян, СНО - культура клеток яичников хомяка и др. Клетки выращивают в специальных средах в планшетах, наблюдают за их состоянием и ростом под микроскопом. Оказалось, что под действием токсина они умирают, и степень поражения пласта клеток зависит от количества внесенного токсина. Оценить действие токсина можно под микроскопом визуально или используя специальные красители, окрашивающие только живые клетки, и судить по интенсивности окраски: интенсивность окраски убывает при увеличении дозы токсина, то есть при увеличении его повреждающего действия. Если в пробе содержится достаточно много защитных антитоксических антител, то клетки оказываются полностью защищенными и не умирают, так как антитела полностью блокируют, нейтрализуют токсин. При меньших дозах антител возможно частичное разрушение пласта клеток. При использовании серии разведений сыворотки можно найти то разведение, которое и обеспечивает полную защиту, то есть титр токсин-нейтрализующих антител.

И зарубежный, и наш опыт показал, что преимущества способа использования культур клеток для определения активности токсина и для постановки реакции нейтрализации в том, что он более прост, стандартен и позволяет давать более точную количественную оценку. Однако и этот метод имеет существенный недостаток, так как может быть использован только в специальных лабораториях, имеющих соответствующее оборудование для работы с живыми клетками. Вот почему возник вопрос о разработке такого метода оценки, который был бы доступен большинству практических лабораторий. Такой метод был разработан в нашей лаборатории. В лаборатории получены моноклональные антитела к той части дифтерийного токсина, который определяет его связь с клеткой. Полистироловый планшет, покрытый такими антителами (они прочно связаны с поверхностью лунок), будет так же связывать токсин из испытуемой пробы, как и клетка. Поэтому можно измерить количество связывающегося токсина, как при простом титровании токсина, так и при постановке реакции нейтрализации. В этих случаях количество связавшегося токсина определяется с помощью реактивов, дающих цветную реакцию, и может быть измерено.

Для оценки эффективности вакцинации и для прогнозирования течения болезни очень важно исследовать напряженность иммунитета. По данным ВОЗ, разное содержание антитоксических антител обеспечивает разный уровень защищенности человека: меньше 0,01 ME/ мл - человек восприимчив к дифтерии; 0,01 МЕ/мл - минимальная степень защищенности; 0,01-0,09 МЕ/мл - некоторая степень защиты; 0,1 МЕ/мл - защитный уровень антител; более 1,0 МЕ/мл - стойкая, длительная невосприимчивость к дифтерии.

В сравнительных исследованиях при постановке реакции нейтрализации в культуре клеток или при постановке ИФА с использованием моноклональных антител к токсину нами было показано, что имеется полная корреляция находимых уровней антител в обоих случаях. Этот метод прост, доступен любой лаборатории, точен и позволяет быстро (за 5-6 часов) получить результат.

Нина ТИТОВА, ведущий научный сотрудник лаборатории клеточных гибридов НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН