Опубликовано в журнале:
»» №3'99

Ускоренный отбор эффективных антибиотиков для лечения больных госпитальными инфекциями

Материалы настоящей работы доложены на научной конференции "Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней" 27-28.10.99 /4/

Пригодная для ускоренного отбора предпочтительных антибиотиков в лечении гнойно-септических заболеваний питательная среда содержала 0,5% глюкозы, а в качестве индикатора бромкрезолпурпур. Большинство патогенных бактерий по мере размножения сдвигают рН питательной среды, что может быть зарегистрировано.

При изучении размножения в цветной питательной среде лабораторных культур бактерий показано, что оптимальное число бактерий для ускоренного метода составляет 5*10⁷ микробных клеток, которое позволяет в короткое время осуществить анализ антибактериальной активности антибиотиков в луночках пластины, не опасаясь контаминации их посторонними бактериями.

Апробация ускоренного способа на больных госпитальными гнойными инфекциями подтвердила возможность практического применения ускоренного способа выбора предпочтительных антибиотиков без выделения чистых бактериальных культур.

Speeded choice of effective antibiotics for hospital infection illness curing

M.I. Levy, Yu.G. Suchkov, V.Ja. Prochorow, V.A. Terushkin
Experimental Laboratory Center of MMCD, Institute of epidemiology and microbiology name N.F. Gamalea, Moscow city 67 clinic hospital

Nutritious medium valid for speeded choice of the antibiotics preferable for purulent septic illness curing contains 0,5% glucose and brorncresolepurpure as indicator. The most of pathogen bacteria by it grows changes the nutritious medium рН value and that can be registered.

By the examination of laboratory bacteria cultures grows in colored mutritious medium it was shown that optimal bacteria number for the speeded method is 5*10⁷ microbe cells. This number is valid to fulfil antibiotics antibacterial activity analysis in plate cavities at a short time avoiding external bacteria contamination. Speeded method approbation on the men having hospital purulent illness confirm the possibility of application of speeded method of preferable antibiotic choice without separation of pure bacteria cultures.

Госпитальные инфекции являются актуальной проблемой практического здравоохранения, для борьбы с которыми выбор предпочтительных антибиотиков для конкретных больных служит главным направлением терапии /1, 2/. Проблема усугубляется тем, что "широкое и бесконтрольное применение этиотропных средств быстро привело к появлению резистентных и атипичных форм большинства возбудителей инфекционных болезней. Началась бешеная гонка по созданию все новых и новых антибактериальных препаратов, большинство из которых быстро становились малоэффективными" /3/.

В настоящее время выбор антибиотиков для конкретных больных гнойно-септическими заболеваниями основывается на выделении из отделяемого чистых культур микроорганизмов (иногда отбор антибиотиков начинают еще до выделения чистых культур) и последующего испытания чувствительности их к различным антибиотикам с помощью пропитанных антибиотиками бумажных дисков, помещенных на агар с посевом микроорганизмов /5/. После суточного термостатирования агаровых пластин выбирают те антибиотики, к которым чувствительны выделенные от больного бактерии.

Наши исследования основаны на применении цветных питательных сред, которые получили распространение в начале XX века /6, 7/. Наиболее частое употребление жидких и плотных питательных сред с включением в них цветного индикатора получило в практике анализа материалов от больных чумой. Однако массовое применение цветных питательных сред получило в вирусологии в середине 50-х годов /6/. В предыдущих наших исследованиях было показано, что подавляющее большинство видов патогенных бактерий по мере роста снижают рН питательной среды, что легко регистрируется по конверсии цвета соответствующей питательной среды. Наличие в среде эффективного антибиотика предотвращает изменение цвета /8, 9/. Тогда же была установлена высокая степень корреляции результатов испытания активности антибиотиков в жидкой цветной питательной среде и метода бумажных дисков с антибиотиками /9/, однако первый способ приносит результаты гораздо быстрее, чем второй.

За последние несколько десятилетий изменились технические возможности бактериологического анализа, что позволило разработать ускоренный способ отбора эффективных антибиотиков для лечения гнойно-септических больных /4/. Испытания ведут в стерильных пластмассовых пластинах для иммуно-ферментного анализа. Объем луночки составляет 0,2 мл, а объем реакционной смеси мы определили в 0,15 мл.

В начале исследовали жидкую питательную среду, содержавшую 0,5% глюкозы, с разными индикаторами - феноловый красный, бромкрезолпурпур и бромтимоловый синий. Наиболее чувствительной к изменениям рН была среда с бромтимоловым синим, но наиболее четкие отличия цвета в "положительных" и "отрицательных" луночках отмечены при использовании в качестве индикатора бромкрезолпур-пура. Фенолрот как индикатор пришлось оставить из-за слабой контрастности. После многочисленных испытаний мы остановили свой выбор на цветной питательной среде с бромкрезолпур-пуром, которая имела исходно сиреневый цвет, а после проращивания в ней бактерий приобретала желтый цвет.

Вначале исследовали воздействие на цветную питательную среду представительных бактериальных культур - Е.coli, St.aureus, В.cereus, В.subtilis, Ps.aeruginosa, Y.pestis, Y.pseudotuberculosis (таблица 1). Была избрана концентрация бактерий 5*10⁷. В этом случае требовалось максимум 3-4 генерации при термостатировании для достижения той концентрации, при которой неминуемо происходит изменение цвета питательной среды. А это занимает не более 4-6 часов.

Как правило, результаты испытаний бактериальных культур ускоренным способом и по методике бумажных дисков совпадали. Для учета результатов мы обращали основное внимание на те луночки, в которых проявился ярко выраженный желтый цвет, идентичный с цветом в контрольных луночках, где бактериальную культуру не смешивали с антибиотиками, а вместо него брали питательную среду. В некоторых случаях, особенно при высоких концентрациях антибиотика, он сам по себе несколько изменял цвет питательной среды, но при этом существенно отличался от желтого в контроле. Как показывает опыт, учет результатов испытаний возможен не только визуальный, но и инструментальный в аппарате Multiscan при фильтре 450 nm.

Возможная контаминация луночек посторонними бактериями не сказывалась на результатах, так как этим бактериям требуется неизмеримо больше времени для конверсии цвета питательной среды - ведь количество случайно попавших бактерий невелико. В специальных опытах мы заполняли луночки пластин только питательной средой и оставляли пластины при 37°С и при комнатной температуре. При температуре 37°С отдельные луночки с пожелтевшей питательной средой появлялись после 24 часов, а если пластины оставлялись при комнатной температуре - через 72 часа. Поэтому соблюдение излишней стерильности манипуляций при выполнении ускоренного способа не требуется.

После исследования лабораторных культур бактерий приступили к апробации ускоренного способа на гнойных материалах от больных (без предварительного выделения чистых культур бактерий). Всего исследовали 25 больных, находившихся на излечении в стационаре. Материал забирали ватным квачом, который затем погружали в цветную питательную среду, тем самым разводя его примерно в 50-100 раз. Параллельно материал исследовали микроскопически в мазках, окрашенных по Граму, а также в посевах на агар с бумажными дисками.

В луночки пластин вносили разные антибиотики, которые титровали с помощью автоматических пипеток в объеме 0,1 мл в цветной питательной среде. Затем в луночки с разведениями антибиотиков вносили по 0,05 мл исследуемою материала, который был получен после погружения в питательную среду ватною квача. В пластине предусматривались надлежащие контроли: питательной среды самой по себе, исследуемого материала в питательной среде, антибиотиков в питательной среде. Пластины помещали в термостат при 37°С на 4-6 часов. Там же находились агаровые пластины, засеянные исследуемым материалом, с бумажными дисками - на 24 часа.

Принятый подход позволял через короткое время определячь по мазкам наличие моно- или смешанной инфекции. Примерно в половине случаев выбор предпочтительного антибиотика и его лечебная дозировки мог быть сделан ускоренным способом уже через 4 часа, а через 6 часов эта цифра возрастала примерно до 80% (некоторая часть материалов не содержала бактерий, способных расти на нашей питательной среде). Через 24 часа на агаровых пластинах с бумажными дисками по диаметру свободных от бактериального роста зон мы также могли выбрать наиболее эффективные антибиотики, сравнив эти данные с результатами, полученными ускоренным методом. Иногда в зоне задержки роста на агаре можно было отметить наличие колоний бактерий (смешанная инфекция в исследуемом материале), что позволяло рекомендовать в ряде случаев комбинацию разных антибиотиков для лечения. Сводные результаты анализа материалов от больных представлены в таблице 2.

Таблица 1 Чувствительность бактериальных культур к антибиотикам при исследовании предлагаемой (1) и рутинной (2) методиками

Таблица 2 Результаты определения чувствительности к антибиотикам бактерий из гнойного отделяемого больных [учет (1) - через 4 часа, учет (2) - через 20-24 часа]

Таблица 3 Сравнение результатов испытания материалов от больных гнойными инфекциями ускоренным способом и методом бумажных дисков

В процессе исследования материалов от больных мы смогли убедиться в том, что ускоренный метод позволяет уже через несколько часов после получения материала рекомендовать предпочтительные антибиотики и завершить весь комплекс исследований, в том числе и путем применения бумажных дисков, к концу первых суток без выделения чистых культур бактерий.

На материале, полученном от больных гнойными инфекциями, мы смогли убедиться в том, что ускоренный метод и способ бумажных дисков при выборе предпочтительных антибиотиков дают совпадающие результаты (таблица 3). В качестве примера выбрали данные для пяти больных и семи антибиотиков.

Результат сопоставления обычно был позитивный, но иногда этого не наблюдали, что, вероятно, объясняется смешанной инфекцией.

После учета результатов ускоренного способа во все луночки пластины приливали формалин до концентрации 0,5% в луночке и выдерживали пластину в таком состоянии 30 минут. При этом преследовали две цели: дезинфекция содержимого луночек, то есть инфекционных агентов в исследуемом материале, и сохранение окраски цветной питательной среды, достигнутой к моменту учета результатов (после этого возможен инструментальный учет в аппарате типа Multiscan).

Что касается пластмассовых пластин, использованных в ускоренном способе, то после дезинфекции и тщательной отмывки луночек от дезинфекционного средства их можно было использовать повторно. Но настоящая работа выполнена только на стерильных одноразовых пластинах фирмы Titerteck, так как в противном случае требовались тщательные доказательства отмывки луночек от дезинфектанта.

На основании изучения ускоренного способа выбора предпочтительных антибиотиков были разработаны три сорта наборов ингредиентов в зависимости от опыта и оснащенности бактериологической лаборатории - минимальный, полный и абсолютный, которые достаточны для практического воплощения ускоренного способа.

Выводы

1. Подавляющее большинство патогенных бактерий при размножении в жидкой питательной среде сдвигают ее рН, что может быть зарегистрировано визуально или инструментальным способом. Из испытанных индикаторов предпочтение было отдано бромкрезолпурпуру.

2. На основании изучения размножения в питательной среде бактерий нескольких лабораторных культур были избраны оптимальная концентрация бактерий и время учета результатов испытаний, а также разработаны технические детали ускоренного способа.

3. Апробация ускоренного способа на больных госпитальными гнойными инфекциями подтвердила возможность практического применения ускоренного способа выбора предпочтительных антибиотиков без выделения чистых культур.

Литература

1. Шевченко Ю.Л., Хубулава Г.Г., Шихвердиев. Гнойно-септическая кардиохирургия - новое направление в хирургии сердца. Инфекционные болезни: взгляд в будущее. Материалы научной конференции "Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней", с. 5-16. Санкт-Петербург, 1999.
2. Лобзин Ю.В. Современные концепции и приоритеты терапии инфекционных больных. Там же, с. 17-31.
3. Шевченко Ю.Л. Приветствие научной конференции. Там же, с.1-4.
4. Леви М.И., Сучков Ю.Г. Ускоренный отбор предпочтительных антибиотиков для терапии больных с гнойными осложнениями. В кн.: "Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней", с.35-36, Санкт-Петербург, 1999.
5. Навашин С.М., Фомина И.Л. Рациональная антибиотикотерапия. Москва, 1982.
6. Под редакцией М.О. Биргера. Справочник по микробиологическим методам исследования. Москва, 1972.
7. Наставление по основам лабораторной техники при работе с возбудителями особо опасных инфекций. Алма-Ата, 1975.
8. Леви М.И., Горожанкина И.А., Сагатовская Л.А. Быстрый метод определения чувствительности бактериальных культур к различным антибиотикам в жидкой среде. В кн.: "Стратегия и тактика анти-биотикотерапии", с. 69-70, Краснодар, 1966.
9. Леви М.И., Горожанкина И.А., Сагатовская Л.А. Быстрый метод определения чувствительности бактериальных культур к различным антибиотикам в жидкой среде. Антибиотики, 1967, N1, с. 57-65.
10. Сэнфорд Дж., Гилберт Д., Гербердинг Дж., Сэнде М. Антимикробная терапия. Москва, 1996.