Опублиовано в журнале:"Transfusion Alternatives in Transfusion Medicine; ISSN: 1295-9022, Volume 9, Number 3, September 2007."

Влияние различий в химическом строении гидроксиэтилкрахмалов, произведенных из кукурузы и картофеля, на их терапевтические свойства.

Klaus Sommermeyer, PhD, Franz Cech, PhD, Richarda Schossow Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Germany

Краткий обзор

Гидроксиэтилкрахмалы - плазмозамещающие растворы, синтезированные из различного растительного сырья, могут иметь различные физико-химические свойства и клинические особенности. В данной статье приведена сравнительная характеристика физико-химических свойств двух гидроксиэтилкрахмалов (ГЭК) со средней молекулярной массой 130 кДа и молярным замещением 0,4 и 0,42, произведенных из крахмала кукурузы или картофеля соответственно. У ГЭК, синтезированного из кукурузного крахмала, были выявлены более разветвленная структура и меньшая степень этерификации остатками ортофосфорной кислоты, по сравнению с ГЭК, синтезированным из картофельного крахмала. Согласно распределению по Марку-Хоуинку ГЭК, произведенные на основе картофельного крахмала, обладают большей предельной вязкостью не зависимо от молекулярной массы ГЭК, по сравнению с ГЭК, синтезированными на основе кукурузного крахмала. Влияние этих особенностей на фармакологические свойства ГЭК дискутируются. ГЭК, синтезированные на основе кукурузного и картофельного крахмала, имеют различную химическую ультраструктуру. Фармакологическая и клиническая эквивалентность этих препаратов должна быть подтверждена дальнейшими исследованиями.

Ключевые слова

Химическая структура
Гидроксиэтилкрахмал
Плазмозамещающий раствор
Источник крахмала

Введение

Использование гидроксиэтилкрахмалов (ГЭК) в клинической практике стало возможным благодаря успешным результатам длительных исследований по изучению искусственных плазмозамещающих растворов.1-4 Молекулярная структура ГЭК представляет собой полимер, состоящий из глюкозных остатков с замещенными гидроксиэтиловыми группами. Основными характеристиками ГЭК являются средняя молекулярная масса (Mw), молярное замещение (MS) - отношение количества гидроксиэтиловых групп к общему количеству молекул глюкозы, отношение С2/С6, характеризующее отношение количества гидроксиэтиловых групп, расположенных у второго атома углерода к количеству гидроксиэтиловых групп, расположенных у шестого атома углерода в глюкозном кольце. Первым гидроксиэтиловым крахмалом, использованным в клинической практике, стал препарат, изготовленный из кукурузного амилопектина,5 имеющего разветвленную структуру, сходную с молекулой натурального человеческого гликогена (Hespan®, McGaw, Irvine, CA, USA; Mw=450 кДа; MS=0,7).
После внедрения этого вида ГЭК с высокой молекулярной массой, высокозамещенного и длительно циркулирующего в плазме, начали использовать ГЭК с меньшей молекулярной массой, степенью замещения и периодом полувыведения, с улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами и меньшим количеством побочных эффектов. Эти растворы ГЭК были произведены на основе кукурузного амилопектина, имеющего наиболее разветвленную структуру глюкозного полимера, в котором примерно 5 моль% глюкозных остатков соединены а-1-6-гликозидными связями (точки ветвления), а остальные связи представляют собой линейные а-1-4-гликозидные связи.

Недавно на рынке были представлены ГЭК, произведенные на основе картофельного крахмала. Эти препараты были заявлены как эквивалентные растворам ГЭК, синтезированным на основе кукурузного крахмала. Данные фармакологической, токсикологической и клинической документации этих препаратов основываются на публикуемых сведениях о свойствах производных кукурузного крахмала.6 Однако следует учитывать наличие физико-химических различий, которые обусловлены разными источниками сырья, и могут приводить к отличию фармакокинетических, фармакологических и клинических свойств ГЭК.

Среднемолекулярный ГЭК (HES 130/0,4, Voluven®, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany) является последним инновационным препаратом, обладающим улучшенными фармакокинетическими свойствами и быстро метаболизирующийся в организме. При этом препарат оказывает волемический эффект, сравнимый с волемическим эффектом ГЭК 200/0,5 (6%) и ГЭК 450/0,7 (Hetastarch).7 Преимуществом данного ГЭК про сравнению с желатином является отсутствие отрицательного влияния на функцию почек.8 Эффективность препарата была подтверждена при проведении гемодилюции у больных с острым снижением слуха.9 Волювен произведен на основе кукурузного крахмала и имеет молекулярную массу 130±20 кДа, молярное замещение 0,4 и отношение С2/С6 около 9. Эти особенности строения способствуют уменьшению накопления препарата в плазме крови и тканях при повторных введениях. В последнее время на рынке были представлены два препарата ГЭК, изготовленные на основе картофельного крахмала, которые имеют незначительные различия в спецификациях (Venofundin, B.Braun, Melsungen, Germany, средняя молекулярная масса 130 кДа, молярное замещение 0,42; VitaHES KS, Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany, средняя молекулярная масса 130 кДа, молярное замещение 0,42). Ранее было показано несоответствие физико-химических свойств ГЭК 200/0,5, произведенных на основе кукурузы и картофеля, однако так как в процессе производства тетракрахмалы подвергаются более длительному гидролизу их отличия от препаратов, синтезированных из кукурузы, могут быть уменьшены.10 В статье приведен сравнительный анализ физико-химических свойств препаратов и обсуждено их возможное влияние на фармакологические характеристики ГЭК.

Методы

Для проведения исследования раствор ГЭК 130/0,4, Lot 21022 был закуплен у фирмы Fresenius Kabi Deutschland GmbH. Согласно спецификации молярное замещение препарата составляло 0,41, а средняя молекулярная масса 143200 Да. Venofundin 6% (B. Braun, Lots 4343H51, 3472H42-336 и 4385H41-871), и VitaHES KS (Serumwerk Bernburg) были приобретены всвободной продаже. Для этих двух растворов заявленная средняя молекулярная масса составляла 130 кДа и молярное замещение 0,42. Перед проведением исследования жидкие растворы Venofundin и VitaHES были подвергнуты сухой заморозке для определения доли натрия хлорида. Определяли среднюю молекулярную массу, распределение значений молекулярной    массы,    константу К распределения Марка-Хоуинка как для неэстерифицированных, так и для эстерифицированных остатками фосфорной кислоты молекул как описано в работах Sommermeyer и Sommermeyer и соавт.

Степень ветвления

Степень ветвления молекулы ГЭК оценивают согласно модифицированной методике Nilsson и соавт. при помощи Н ядерного магнитного резонанса в растворе D2O при высокой температуре (80°С) и при воздействии частоты 300MHz. В данных условиях HDO сигнал определяется отдельно от сигналов протонов аномеров. Степень ветвления, выраженная в моль%, рассчитывается как интеграл от количества а-1,6 связанных протонов аномеров в 4,9 миллионных долей (МД), деленный на сумму всех сигналов протонов аномеров (а-1,4 на 5,3 миллионных долей, а- и Р-протонов аномеров в 5,25 и 4,65 миллионных долей соответственно). Достоверность данной методики была подтверждена при использовании анализа метилированных генетических участков.

Молярное замещение, степень замещения и отношение С2/С6

Для определения молярного замещения, степени замещения и отношения С2/С6 использовали метод высокочувствительной жидкостной хроматографии (ВЧЖХ), наиболее используемый по данным литературы.14 Метод основан на гидролизе ГЭК серной кислотой до глюкозных олигомеров и их последующего разделения при жидкостной хроматографии и определения коэффициента преломления. По данным литературы пики идентификации соответствовали пикам, получаемыми при исследовании синтезированных образцов гидроксиэтилглюкозы. Однако согласно исследованию Ferber результаты, полученные при исследовании 1,2-0-этиленглюкозы отличались от данных анализа других моно- или ди- замещенных гидроксиэтиловых изомеров глюкозы. Были подтверждены значения молярного замещения, отношения С2/С6 и степени замещения при проведении отдельных измерений для стандартных ГЭК методом газовой хроматографии согласно данным литературы.

Высокочувствительная жидкая хроматография

Система ВЧЖХ состоит из помпы (Shimadzu), инжекторной системы (Rheodyne), детектора коэффициента преломления (Waters 410 Differential-Refractometer), нагревателя колонки (Temperature Control System Waters TCM), системного блока и программного обеспечения (Agilent  Work   Station),      колонка:   Spherisorb   Silica   5   мкм,   250x4,6   мм,      элюент: ацетонитрил/вода/диаминобутан (820 мл/180 мл/ 0,1 мл), поток: 1,5 мл/мин, нагревателя колонки: 30 °С. Молярное замещение и степень замещения рассчитывали по пикам моно-замещенных, ди-замещенных и незамещенных глюкозных единиц, как было описано выше. Для 1,2-О-этиленглюкозы был использован показатель ответа, идентичный ответу на другие моно-замещенные изомеры гидроксиэтилглюкозы 0,755. В качестве примера приведена хроматограмма, включающая пик определения вещества (Рисунок 1).

Рисунок 1. Хроматограмма гидролизованного гидроксиэтилкрахмала 130/0,4 Ch.-B.: 21022, выполненная методом высокочувствительной жидкостной хроматографии.

Время экспозиции:
4,24 минуты	1,2-О-этилен-глюкоза
7,37 минуты	2,3-ДиГЭГ
8,26 минуты	2,6-ДиГЭГ
9,22 минуты	2,2-ГЭтГ
9,54 минуты	3-ГЭГ
10,34 минуты	2-ГЭГ
13,18 минуты	6-ГЭГ
17,02 минуты	глюкоза
ГЭГ - гидроксиэтилг ГЭтГ - гидроксиэтою	люкоза сиглюкоза

Результаты

В таблице 1 приведены сводные данные по характеру замещения, наличию и отсутствию связывания с фосфорной кислотой, значения средней молекулярной массы и распределение значений молекулярной массы, характеризующееся основанием и пиком, равным 10% и 90% соответственно, пиков распространения в геле на хроматографической хроматограмме. Каждое из значений представлено в виде средней величины двух переменных. Параметры а и К распределения Марка-Хоуинка приведены дополнительно к соответствующему распределению представленному на рисунке 2.

Таблица 1. Химическая структура исследованных препаратов ГЭК

Параметр	ГЭК 130/0,4 (на основе картофельного крахмала)				ГЭК 130/0,4 (на основе кукурузного крахмала)
	Ch.-B.: 3472H42-336T	Ch.-B.: 4385H41-871T	Ch.-B.: 4343H51T	Ch.-B.: 0014J	Ch.-B.: 21022§
Молярное замещение	0,45	0,46	0,46	0,45	0,41
Степень замещения	0,39	0,41	0,41	0,39	0,34
Отношение С2/С6	7,4	6,9	7,7	7,6	9,05
Степень ветвления (моль%)	5,1	5,0	4,8	5,1	6,6
Свободные фосфаты     (как фосфор) (МД)	34	53	63	84
Общее количество фосфатов    (как фосфор) (МД)	205	259	287	290	15
Молекулярная масса (Да)	152,177	151,621	153,943	149,762	143,200
Основная фракция      10% (Да)	39,340	29,354	21,133	22,945	30,460
Пиковая фракция      90% (Да)	328,882	351,124	375,783	365, 331	313,700
Константа     К* распределения по         Марку-Хоуинку	0,00349	0,00352	0,00273	0,00298	0,00229
Константа     а* распределения по         Марку-Хоуинку	0,329	0,330	0,348	0,342	0,353

*(η) = К·Ма; †VenofundinTM; ‡VitaHESTM; § VoluvenTM.

Рисунок 2. Распределение по Марку-Хоуинку результатов многокомпонентной высокочувствительной гелевой хроматографии

Обсуждение

Замещение гидроксиэтиловыми группами, молекулярная масса

Согласно результатам, представленным в таблице 1, и в соответствии с характеристиками фирмы-поставщика молярное замещение и степень замещения несколько выше у ГЭК, являющихся производными картофельного крахмала. Отношение С2/С6 у этих препаратов значительно ниже. Данные литературы свидетельствуют, что оба эти параметра влияют на фармакокинетику плазмозамещающих растворов ГЭК.1-3.
Средняя молекулярная масса, основная и пиковая фракции обоих видов ГЭК достоверно не различались. Как замещение, так и молекулярная масса являются регулируемыми в процессе синтеза параметрами и не зависят от вида используемого сырья.

Степень этерификации фосфатными группами

В таблице 1 отражены данные о содержании свободных и связанных фосфатов в различных образцах. Степень эстерификации ГЭК, являющихся производными картофельного крахмала, значительно выше, чем у препаратов, синтезированных на основе кукурузного крахмала. Известно, что крахмал, выделенный из клубней или корней, отличается от крахмала, выделенного зерна, по многим показателям. Картофельный крахмал, как типичный представитель крахмала, полученного из корней, имеет структуру эстерифицированную остатками фосфорной кислоты, содержание которых достигает примерно 3000 - 5000 МД.17,18 В основном эстерификация происходит в положении С6 негидрированного глюкозного остатка амилопектинового компонента картофельного крахмала.19 У производных кукурузного крахмала этерификации фосфорной кислотой не происходит.

Мы подтверждаем, что разница в степени эстерификации фосфатными группами у производных кукурузного и картофельного крахмала выявляется как у ГЭК с более высокой молекулярной массой (со средней молекулярной массой 200 кДа) и степенью замещения 0,5,10 так и у ГЭК с меньшей молекулярной массой (130 кДа) и степенью замещения 0,4 и 0,42.

Снижение исходно высокой степени эстерификации фосфатными группами картофельного крахмала можно объяснить процессом производства ГЭК. Под воздействием высокой температуры в кислой среде контролируемый гидролиз гликозидных связей позволяет достичь необходимой молекулярной массы конечного сырья для производства ГЭК. Во время этапов гидролиза фосфорные группы сложных эфиров подвергаются дальнейшему отщеплению до образования свободных фосфатов, которые выводятся позже при очистке.

Несмотря на меньшую молекулярную массу ГЭК 130/0,42 по сравнению с ГЭК 200/0,5, степень эстерификации фосфатными группами не различалась достоверно у этих двух видов ГЭК. Это означает, что фосфатные связи сложных эфиров относительно стабильны в условиях гидролиза при производстве ГЭК и гидролиз связей сложных эфиров с образованием свободных фосфатов не превосходит процесс гидролиза гликозидных а-1,4 связей.

Степень ветвления

Кукурузный крахмал содержит только амилопектин с высокой степенью ветвления. В отличие от ГЭК, синтезированных на основе кукурузного крахмала, ГЭК, произведенные из картофельного крахмала известны не так давно. Генетически модифицированный картофель содержит большое количество амилопектина.18 Исходное сырье для производства ГЭК на основе картофеля является смесью амилопектина и амилозы, линейного полимера глюкозы, который составляет 20-30% от общей массы. Молекулярная масса амилозной части ниже молекулярной массы пектина, но значения молекулярной массы этих компонентов находятся в одном диапазоне и составляют несколько миллионов Дальтон.

Таким образом, средняя степень ветвления производных кукурузного крахмала выше, чем у препаратов, синтезированных на основе картофельного крахмала (таблица 1). Также существует разница в степени ветвления амилопектинового компонента, как в кукурузном, так и картофельном крахмале, что тоже влияет на структурные отличия препаратов, синтезированных из разных источников сырья.

Важно отметить, что в отличие от крахмалов, произведенных на основе кукурузного крахмала, ГЭК, синтезированные из картофельного крахмала, представляют собой негомогенную смесь гидроксиэтилированных линейных структур амилозы и гидроксиэтилированных разветвленных структур амилопектина.

Гидроксиэтилирование происходит во время синтеза, значит оба компонента должны иметь одинаковую степень замещения гидроксиэтиловыми группами. Гидроксиэтиламилоза не имеет разветвленных участков негидрированных глюкозных последовательностей, соответственно, отсутствуют а-1,6 гликозидные связи, т.е. они и соседние с ними связи в точках ветвления не могут быть разрушены а-амилазой. Таким образом, 20 - 30% от общего количества ГЭК, произведенных на основе картофеля, разрушаются и выводятся быстрее, чем оставшаяся часть, не содержащая амилопектина.

Распределение по Марку - Хоуинку

Распределение по Марку - Хоуинку является линейной зависимостью логарифма предельной вязкости и логарифма молекулярной массы полимерного образца. Эта зависимость дает информацию о структуре вещества. Распределение по Марку - Хоуинку выявляет значительное различие продуктов, произведенных на основе картофельного крахмала, и продуктов, произведенных на основе кукурузного крахмала. При анализе образцов производных картофельного крахмала выявили параллельное смещение в сторону повышения предельной вязкости (рисунок 2). Это означает, что производные картофельного крахмала с аналогичной молекулярной массой обладают большей гидродинамической емкостью, учитывая, что гидродинамическая емкость пропорциональна предельной вязкости.

Такой сдвиг при распределении по Марку - Хоуинку может быть обусловлен фосфорилированием производных картофельного крахмала, вследствие чего полимер приобретает отрицательный заряд, что может приводить к увеличению гидродинамической емкости. Учитывая высокую ионизацию элюирующего буфера во время измерений, степень влияния отрицательного заряда полимера на результаты измерений может быть значительно уменьшена и метод становится более чувствительным для выявления степени ветвления молекул.

Влияние физико-химических различий на клинические и фармакологические свойства

Lehmann и соавт. сравнивали VitaHES (ГЭК 130/0,42, крахмал на основе картофеля) и Voluven (ГЭК 130/0,4, крахмал на основе кукурузы) на здоровых добровольцах.21 Было очевидно показано, что выведение из плазмы и AUC24 у этих препаратов различаются. Lehmann и соавт. также сравнивали свойства VitaHES и ГЭК 200/0,5, синтезированного на основе картофеля, при повторных внутривенных введениях у здоровых добровольцев и продемонстрировали отсутствие накопления в плазме и изменения фармакокинетических параметров в зависимости от длительности применения ГЭК 130/0,42.22 Отрицательно заряженные эстерифицированные фосфатные группы ГЭК, синтезированных на основе картофеля, могут негативно влиять на систему гемостаза и метаболизм в печени. Jamnicki и соавт.23 выявили различия во влиянии на коагуляцию ГЭК, производных картофельного крахмала и производных кукурузного крахмала in vitro. ГЭК, синтезированные на основе картофельного крахмала, усиливают лизис сгустка, в отличии от ГЭК, произведенных из кукурузного крахмала.

Опубликовано незначительное количество сведений о ГЭК, синтезированных на основе картофельного крахмала. Поэтому часто фармакологические и токсикологические характеристики ГЭК, произведенных из картофельного крахмала, описывают, основываясь на результатах, полученных при исследовании ГЭК, синтезированных из кукурузного крахмала. Свойства препаратов ГЭК, произведенные на основе кукурузного крахмала, описаны в огромном количестве опубликованных научных исследований и обобщены в несколько обзорных монографий.

В недавно опубликованном исследовании сравнивали волемические свойства небольших доз производных картофельного крахмала ГЭК 200/0,5 и ГЭК 130/0,4 при проведении гинекологических операций.24 При использовании небольших доз препаратов - около 17,5 мл/кг (ГЭК 130/0,4) и 19,8 мл/кг (ГЭК 200/0,5) были выявлены их эквивалентные свойства. Однако при использовании ГЭК 200/0,5 через 6 часов после оперативного вмешательства было зарегистрировано значительное снижение уровня гематокрита, в отличие от группы ГЭК 130/0,4, что подтверждает различные свойства препаратов. В другом исследовании при использовании ГЭК, производных картофельного крахмала, в послеоперационном периоде отмечали билирубинемию. Такие побочные эффекты у ГЭК, произведенных из кукурузного крахмала, отсутствуют. Данный побочный эффект мог быть последствием оперативного вмешательства, однако учитывая физико-химические свойства ГЭК, производных картофельного крахмала, можно предположить, что билирубинемия могла быть обусловлена применением препарата ГЭК.

Как и при использовании ГЭК, производных кукурузного крахмала, применение сбалансированного  ГЭК   130/0,42,   изготовленного   на   основе   картофельного   крахмала, приводило к меньшим нарушениям кислотно-основного состояния по сравнению с несбалансированными растворами.25 Исследования коагуляции in vitro с использованием тромбоэластографии выявили менее выраженные побочные эффекты при использовании сбалансированных растворов, чем при использовании несбалансированных.26 В исследовании септического шока на свиньях, при повышенной капиллярной проницаемости ГЭК 130, синтезированный на основе картофельного крахмала, приводил к стабилизации волемического статуса и коллоидно-осмотического давления. Однако, учитывая незначительное количество исследований, в том числе и клинических, проведенных с использованием ГЭК, произведенных из картофельного крахмала, нельзя делать окончательный вывод о степени эквивалентности ГЭК, синтезированных на основе картофельного и кукурузного крахмалов.

Заключение

Гидроксиэтилкрахмалы, синтезированные из картофельного и кукурузного крахмалов, отличаются по химической ультраструктуре. Фармакологическая и клиническая эквивалентность этих препаратов должна быть определена в последующих исследованиях.

Литература:

1. Mishlcr JM. Pharmacology of Hydroxy' ethyl Starch. Use in Therapy and Blood Banking. Oxford University Press: Oxford. New York, Toronto. 1982.
2. Pelcr K, SchimEtta W, bergmann H. et al HydroxySthyhtUrke (HESJ - Aktutlte Tbe-orie und Praxis - Bcitrdgc гиг Aneasthe­siologic und Intenwmediztn 26, Verlag Wilhclm Maudrich: Wien-MOnchen-Bern. 1988.
3. Lawin P. Zander J, Wcidlcr B. Hydroxy-ethyl Starch: A Current Overview, Gcorg Thiem* VP Над: Stuttgart. New York, 1989.
4. Junghcinrich Ct Neff ТА. Pharmacokinet­ics of hydroxyethyl starch. Clin Pharma-cokincl 200S; 44: 681-99.
5. Mithoon NK, Caldwell RA. a(l-4) Glucan chain disposition in models of a(l-4)(1-G) gluccins: comparison with structural data for mammalian glycogen and waxy amy-lopcctin. Carbohydr Polym 1999; 40: 191-209.
6. SPC (Summary of Product Characteris­tics), European MRP Registration. Veno-fiindin, B. Braun Melsungen. Germany.