Опубликовано в журнале:
«АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ»; № 55; 2010; стр. 11-12.

Изучение противовирусной активности Ингавирина^® в отношении возбудителя «мексиканского» пандемического гриппа A/H1N1/2009 in vitro и in vivo

С. Я. ЛОГИНОВА¹, С. В. БОРИСЕВИЧ¹, В. Н. ЩУКИНА¹, М. В. ЛЫКОВ¹, Г. В. БОРИСЕВИЧ¹, В. П. БОНДАРЕВ¹, В. Е. НЕБОЛЬСИН², О. А. СУТОЧНИКОВА³ , А. Г. ЧУЧАЛИН³

¹ Филиал федерального государственного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации» - «Вирусологический центр», Сергиев Посад
² Открытое акционерное общество «Валента Фармацевтика», Москва,
³ Научно-исследовательский институт пульмонологии, Москва

Изучена и доказана высокая противовирусная эффективность Ингавирина^® in vitro и in vivo в сравнении с препаратом контроля Арбидолом^® в отношении «мексиканского» пандемического вируса гриппа A/H1N1/2009, штаммы А/Саliforniа/04/ 2009(H1N1) и A/California/07/2009(H1N1), при лечебном и профилактическом способе применения.

Ключевые слова: грипп A (H1N1), Ингавирин^® , противовирусная активность.

Study of Ingavirin^® Antiviral Activity against Mexican Pandemic Influenza Virus A/H1N1/2009 in vitro and in vivo

S. Ya. Logi Nova, S. V. Borisevich, V. N. Shchukina, M. V. Lykov, G. V. Borisevich, V. P. Bondarev, V. E. Nebolsin, 0. A. Sutochnikova, A. G. Chychalin
Virusological Centre, Branch of Central Research Institute No. 48 of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Sergiev Posad
Valenta Farm, Moscow
Research Institute of Pulmonology, Moscow

High in vitro and in vivo efficacy of Ingavirin^® against the Mexican pandemic influenza virus A/H1H1/2009. strains A/California/ 04/2009 (M1N1) and A/California/07/2009 (H1N1) vs. the reference drug Arbidol^® was studied and verified when used therapeutically and prophylactically.

Key words: influenza virus A (H1N1), Infavirin, antiviral activity.

В августе 2010 года Всемирная организация здравоохранения объявила о завершении пандемии гриппа A/H1N1/2009, в результате которой произошло замещение сезонного вируса гриппа A(H1N1) новым пандемическим возбудителем гриппа A(HlNl)-2009 [1]. Установившаяся циркуляция возбудителя гриппа A(HlNl)-2009 в сезон 2010/2011 гг. наравне с распространением вирусов гриппа A(H3N2) и В [2] обосновывает актуальность изучения эффективности нового отечественного противовирусного препарата Ингавирин^® в отношении «мексиканского» пандемического вируса гриппа A/H1N1/09.

К настоящему времени стратегия отбора эффективных неспецифических медицинских средств защиты для многих вирусных инфекций описана в руководствах по доклинической оценке лекарственных средств [3,4].

Ранее была показана противовирусная эффективность in vitro и in vivo нового отечественного химиопрепарата Ингавирин^® в отношении эпидемически и предпандемически значимых подтипов H3N2, H5N1 вируса гриппа типа А, вируса гриппа В и аденовируса [5-11]. Кроме того, была показана эффективность Ингавирина^® в отношении возбудителя пандемического гриппа A/H1N1/09 в культуре клеток MDCK [12]. На втором этапе исследований необходимо было провести оценку эффективности препарата на лабораторных животных и завершить исследования в культуре клеток.

Целью представленной работы являлась оценка эффективности Ингавирина^® in vitro и in vivo в отношении «мексиканского» пандемического вируса гриппа A/H1N1/09.

Материал и методы
Вирус. В работе использовали вирус гриппа, штаммы A/California/04/2009(H1N1) и A/California/07/2009(H1N1), полученные из ФГУ «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора. Все штаммы хранятся в Специализированной коллекции Филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России - ВЦ».

Культура клеток. Использована постоянная культура клеток почек собаки - MDCK. В качестве ростовой среды и среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 7,5 и 2% фетальной сыворотки теленка, соответственно.

Монослой клеток MDCK инфицировали вирусом гриппа А при температуре 37°С в течение 60 мин в дозе 0,001 ЦПД50 Оценку цитопатической активности вируса в присутствии и отсутствии химиопрепаратов проводили с использованием светового микроскопа. Исследуемый препарат вносили спустя 1 час после инфицирования монослоя.

Лабораторные животные. Для моделирования экспериментальной формы гриппа А использовали белых мышей массой 10-12 г, полученных из вивария филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России - ВЦ».

Исследуемый препарат. Ингавирин^® производства ОАО «Валента Фарм», Россия.

Препарат сравнения. Арбидол^® производства ЗАО «Фармстандарт», Россия.

Титрование возбудителя гриппа А. Биологическую активность оценивали титрованием вируссодержащей суспензии в РКЭ (lg ЭИД₅₀/мл) и по ЦПД в культуре клеток MDCK.

Оценка противовирусной эффективности Ингавирина^® осуществлена в соответствии с официальными требованиями [4]. Изучение активности Ингавирина^® в отношении вируса гриппа А проводили на белых мышах, инфицированных интраназально в дозе 1,1х10³ ИД₅₀. Препарат вводили по профилактической (за 5 суток до инфицирования, ежедневно однократно в дозе 5 мг/кг) и лечебной (через 24 ч после инфицирования и далее в течение 5 суток однократно в дозе 15 мг/кг) схемам.

Препарат контроля Арбидол^® вводили в дозах и схемах в соответствии с Инструкцией по его медицинскому применению с учётом равноэквивалетности доз для человека.

Основными критериями оценки эффективности in vitro являлись:
- коэффициент ингибирования гемагглютинирующей активности (Ки, %);
- коэффициент подавления цитопатической активности вируса (%).

Основным критерием оценки эффективности препаратов in vivo являются показатели уровня ингибирования формирования специфического гемагглютинина и уровня накопления вируса в легких белых мышей на 5 и 7 сутки после инфицирования (Ки, % и Δ, lg).

Результаты и обсуждение
Результаты изучения эффективности лекарственных препаратов в культуре клеток MDCK в отношении вируса гриппа, штаммы A/California/ 04/2009(HlNl) и A/California/07/2009(H1N1), по подавлению цитопатической активности вируса свидетельствуют, что Ингавирин^® эффективно ингибирует размножение вируса в культуре клеток (табл. 1). Коэффициент подавления цитопатической активности вируса гриппа А (Н1N1) составил 60,0 и 56,7% для штаммов A/California/04/ 2009 и A/California/07/2009 соответственно. Арбидол^® также ингибирует размножение вируса в культуре клеток, но в меньшей степени. Коэффициент подавления цитопатической активности составил 36,7% для обоих штаммов. Сравнительный анализ полученных данных установил, что препарат Ингавирин^® статистически более эффективно (с вероятностью 0,95) подавляет цитопатическую активность обоих штаммов вируса гриппа A (H1N1), чем Арбидол^® . Важно отметить, что эффективность Ингавирина^® в культуре клеток MDCK в отношении нового подтипа H1N1 вируса гриппа А по подавлению цитопатической активности сопоставима с таковыми показателями в отношении «сезонного» возбудителя гриппа А, подтип H3N2 (10).

Таблица 1.

Подавление цитопатического действия вируса гриппа A/H1N1/09 препаратами в культуре клеток MDCK (n=3)

Препарат	Концентрация препарата, мкг/мл	Инфицирующий препарат - вирус гриппа A/H1N1/09, штамм...	Частота ЦПД	Коэффициент ингибирования цитопатической активности вируса, X±σх, %
Ингавирин®	200	A/California/07/09	13/30	56,7±3,2
Арбидол®	25		19/30	36,7±3,2
Контроль без препарата			30/30	-
Ингавирин®	200	A/California/04/09	12/30	60,0±0,0
Арбидол®	25		19/30	36,7±3,2
Контроль без препарата			30/30	-

При изучении способности Ингавирина^® подавлять гемагглютинирующую активность штаммов A/California/04/2009(H1N1) и A/California/ 07/2009(HlNl) вируса гриппа в культуре клеток MDCK установлено, что исследуемый препарат подавляет формирование специфического гемагглютинина возбудителя на 66,7 и 58,3% соответственно (табл. 2). Показатель подавления формирования специфического гемагглютинина вируса гриппа для препарата Арбидол^® составил 50,0% для обоих штаммов. Ингавирин^® более эффективно ингибирует размножение вируса гриппа A(H1N1), штаммы A/California/04/2009 и А/Саlifornia/07/2009 в культуре клеток МДСК, чем препарат сравнения Арбидол^® .

Таблица 2.

Подавление образования специфического гемагглютинина вируса гриппа A/H1N1/09 препаратами в культуре клеток MDCK (n=3)

Препарат	Концентрация препарата, мкг/мл	Инфицирующий препарат - вирус гриппа A/H1N1/09, штамм...	Уровень гемагглютинина, ГА, ед., X±σх	Коэффициент ингибирования гемагглютинирующей активности вируса, X±σх, %
Ингавирин®	200	A/California/07/09	13,3±2,7	58,3±8,3
Арбидол®	25		16,0±0,0	50,0±0,0
Контроль без препарата			32,0±0,0	-
Ингавирин®	200	A/California/04/09	2,7±0,7	66,7±8,3
Арбидол®	25		4,0±0,0	50,0±0,0
Контроль без препарата			8,0±0,0	-

Результаты изучения эффективности Ингавирина^® в отношении экспериментальной гриппозной инфекции A/H1N1/09 у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/ California/07/2009, в дозе 1,1х10³ ИД50 свидетельствуют о том, что препарат эффективно подавляет накопление вируса в лёгких животных (табл. 3) на 5 и 7 сутки после инфицирования (по уровню формирования специфического гемагглютинина). При применении Ингавирина^® по схеме профилактики в дозе 5 мг/кг препарат подавляет образование специфического гемагглютинина в лёгких инфицированных белых мышей на 5 сутки после заражения животных на 89,6%; на 7 сутки - на 83,4%. Уровень накопления гемагглютинина при этом составил 6,7 и 4,0 ед. соответственно. Препарат сравнения Арбидол^® менее эффективно, чем Ингавирин^® , ингибирует формирование специфического гемагглютинина в лёгких белых мышей на протяжении всего срока наблюдения после инфицирования. На 5 и 7 сутки после заражения животных Арбидол^® подавляет формирование специфического гемагглютинина вируса гриппа в органе-мишени при использовании его в качестве профилактического средства на 75,0 и 79,2%, уровень накопления гемагглютинина при этом составил 16,0 и 5,3 ед. соответственно. Уровень гемагглютинина вируса гриппа в лёгких инфицированных белых мышей, не получавших лекарственные препараты, составил на 5 сутки 64 ед., на 7 сутки - 26,7 ед. (см. табл. 3).

Таблица 3.

Подавление накопления вируса гриппа, штамм A/California/07/2009, в лёгких интраназально инфицированных белых мышей при профилактическом и лечебном применении препаратов

Препарат	Схема введения	Доза препарата,	5 сутки после заражения		7 сутки после заражения
			Уровень гемагглютинина, ГА, ед., X±σх	Коэффициент ингибирования формирования специфического гемагглютинина в легких, X±σх, процент	Уровень гемагглютинина, ГА, ед., X±σх	Коэффициент ингибирования формирования специфического гемагглютинина в легких, X±σх, процент
Ингавирин®	Профилактическая	5	6,7±1,3	89,6±2,1	4,0±0,0	83,4±4,2
Арбидол®		30	16,0±0,0	75,0±0,0	5,3±1,3	79,2±4,1
Контроль без препарата	-	-	64,0±0,0	-	26,7±5,3	-
Ингавирин®	Лечебная	15	5,3±1,3	89,6±2,1	4,0±0,0	83,4±4,2
Арбидол®		130	21,3±5,3	58,3±8,3	5,3±1,2	79,2±4,1
Контроль без препарата	-	-	53,3±10,6	-	26,7±5,3	-

Таким образом, на 5 сутки после инфицирования изученные препараты, применяемые по профилактической схеме, достоверно эффективно (с вероятностью 0,95) подавляют формирование специфического гемагглютинина вируса гриппа А в лёгких интраназально инфицированных белых мышей, уровень накопления которого статистически достоверно ниже такового показателя в контрольной группе. При этом Ингавирин^® более эффективно подавляет формирование специфического гемагглютинина в лёгких белых мышей, чем Арбидол^® с уровнем значимости p≤0,05. На более поздних сроках наблюдения (7 сутки после инфицирования) только Ингавирин^® достоверно с вероятностью 95% эффективно подавляет формирование специфического гемагглютинина в лёгких, уровень накопления которого статистически достоверно отличается от такового показателя в контрольной группе. Уровень формирования гемагглютинина при использовании Арбидола^® значимо не отличается от контроля, т. е. достоверные отличия отсутствуют (см. табл. 3). При пероральном введении Ингавирина^® по лечебной схеме в дозе 15 мг/кг препарат подавляет образование специфического гемагглютинина на 5 сутки после заражения животных на 89,6%; на 7 сутки - на 83,4% (см. табл. 3). Уровень накопления гемагглютинина при этом составил 5,3 и 4,0 ед. соответственно. Препарат сравнения Арбидол^® при применении по лечебной схеме подавлял формирование специфического гемагглютинина на 5 сутки после заражения животных на 58,3%, на 7 сутки - на 79,2%. Уровень накопления гемагглютинина при этом составил 21,3 и 5,3 ед. соответственно. Уровень гемагглютинина вируса гриппа в лёгких инфицированных белых мышей, не получавших лекарственные препараты, составил на 5 сутки 53,3 ед., на 7 сутки - 26,7 ед. (табл. 3). Анализ полученных данных свидетельствует о том, что на 5 и 7 сутки после инфицирования Ингавирин^® , применяемый по лечебной схеме, достоверно эффективно (с вероятностью 95%) подавляет формирование специфического гемагглютинина в лёгких, уровень накопления которого статистически достоверно отличается от такового показателя в контрольной группе.

При изучении влияния Ингавирина^® на репродукцию вируса гриппа, штамм A/California/ 07/2009, в лёгких интраназально инфицированных белых мышей было установлено, что при применении по схеме профилактики препарат на 5 сутки после заражения снижает уровень накопления вируса на 3,0 lg, при этом коэффициент ингибирования составил 99,9%. На 7 сутки после заражения Ингавирин^® также высокоэффективно ингибировал накопление вируса в органе-мишени. Уровень снижения вируса в лёгких составил 2,8 lg, коэффициент ингибирования - 99,8% (табл. 4). Препарат сравнения Арбидол^® при применении по схеме профилактики снижал накопление вируса на 5 и 7 сутки после заражения на 1,9 и 1,4 lg, при этом коэффициент ингибирования составил 98,6 и 95,5% соответственно. Анализ полученных результатов выявил, что на 5 сутки после инфицирования оба препарата, применяемые по профилактической схеме, достоверно (с вероятностью 95%) эффективно подавляют накопление вируса в лёгких, уровень накопления которого статистически достоверно ниже такового показателя в контрольной группе. Вместе с тем эффективность Ингавирина^® по подавлению накопления вируса в лёгких белых мышей, выше эффективности Арбидола^® с уровнем значимости p≤0,05. На 7 сутки после инфицирования изученные препараты достоверно (с вероятностью 95%) эффективно подавляют накопление вируса в лёгких, уровень накопления которого статистически достоверно отличается от такового показателя в контрольной группе. Ингавирин^® более эффективно подавляет накопление вируса в лёгких белых мышей, чем Арбидол^® с уровнем значимости p≤0,05 (см. табл. 4).

Таблица 4.

Накопление вируса гриппа, штамм A/California/07/2009, в лёгких интраназально инфицированных белых мышей при профилактическом применении препаратов

Препарат	Доза препарата, мг/кг	Изучение биопроб на... сутки после заражения	Уровень накопления вируса в легких, lgЭИД50/мл, X±σх	Снижение уровня накопления вируса, Δ, lg, X±σх	Коэффициент ингибирования накопления вируса, %, X±σх
Ингавирин®	5	5	3,6±0,1	3,0±0,1	99,9±0,0
Арбидол®	30		4,8±0,1	1,9±0,1	98,6±0,2
Контроль без препарата	-		6,6±0,1	-	-
Ингавирин®	5	7	3,6±0,1	2,8±0,1	99,8±0,1
Арбидол®	30		5,0±0,2	1,4±0,2	95,5±2,8
Контроль без препарата	-		6,4±0,1	-	-

При изучении влияния Ингавирина^® на накопление вируса гриппа, штамм A/California/ 07/2009, в лёгких интраназально инфицированных белых мышей при применении по лечебной схеме было установлено, что препарат снижает уровень накопления вируса на 5 сутки после заражения на 2,5 lg, при этом коэффициент ингибирования составил 99,6%. На 7 сутки после заражения уровень накопления вируса снизился на 2,1 lg, коэффициент ингибирования составил 99,1% (табл. 5). Препарат сравнения Арбидол^® подавляет размножение вируса гриппа A/H1N1/09 в лёгких в течение 5 суток после инфицирования животных, о чем свидетельствует уровень накопления вируса - 2,6 lg и коэффициент ингибирования - 99,8%. На 7 сутки после инфицирования снижение репродукции вируса в лёгких белых мышей на фоне приёма Арбидола^® составило всего 1,0 lg, коэффициент ингибирования - 90,4%. Сравнительный анализ результатов исследования эффективности препаратов в отношении вируса гриппа А/Н1N1/09 выявил, что на 5 сутки после инфицирования Ингавирин^® и Арбидол^® , применяемые по лечебной схеме, достоверно эффективно (с вероятностью 95%) подавляют накопление вируса в лёгких, уровень накопления которого статистически достоверно отличается от такового показателя в контрольной группе. На 7 сутки после инфицирования оба препарата достоверно эффективно (с вероятностью 95%) подавляют накопление вируса в лёгких, уровень накопления которого статистически достоверно меньше такового показателя в контрольной группе. При этом следует отметить, что Ингавирин^® более эффективен, чем Арбидол^® с уровнем значимости p≤0,05 (табл. 5).

Таблица 5.

Накопление вируса гриппа, штамм A/California/07/2009, в лёгких интраназально инфицированных белых мышей при лечебном применении препаратов

Препарат	Доза препарата, мг/кг	Изучение биопроб на... сутки после заражения	Уровень накопления вируса в легких, lgЭИД50/мл,X±σх	Снижение уровня накопления вируса, Δ, lg, X±σх	Коэффициент ингибирования накопления вируса, %, X±σх
Ингавирин®	15	5	6,1±0,2	2,5±0,1	99,6±0,2
Арбидол®	130		6,0±0,1	2,6±0,1	99,8±0,0
Контроль без препарата	-		8,6±0,1	-	-
Ингавирин®	15	7	5,3±0,2	2,1±0,02	99,1±0,1
Арбидол®	130		6,4±0,1	1,0±0,1	90,4±1,8
Контроль без препарата	-		7,4±0,1	-	-

Таким образом, результаты изучения эффективности Ингавирина^® по подавлению репродукции вируса в лёгких белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/Калифорния/07/2009(НШ1), выявили, что препарат эффективно подавляет накопление возбудителя в органе-мишени на 5 и 7 сутки после инфицирования при использовании его как по схеме профилактики, так и по схеме лечения [5, 6, 8, 9, 13].

ЛИТЕРАТУРА

1. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Минздрав РФ, 2000.
2. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Минздрав РФ, 2005.
3. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А. и др. Изучение лечебной эффективности нового отечественного химиопрепарата Ингавирин^® в отношении возбудителя гриппа A (H3N2). Антибиотики и химиотер 2008; 7-8: 27-30.
4. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А. и др. Изучение профилактической эффективности нового отечественного препарата Ингавирин^® в отношении возбудителя гриппа A (H3N2). Там же 2008; 11-12: 19-21.
5. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А. и др. Изучение эффективности Ингавирина^® in vitro в отношении возбудителя аденовирусной инфекции. Там же 2009; 7-8: 16-18.
6. Колобухина Л. В., Малышев Н. А., Меркулова Л. Н. и др. Изучение эффективности и безопасности нового противовирусного препарата Ингавирин^® при лечении больных гриппом. Русс мед журн 2008; 22: 1-5.
7. Колобухина Л. В., Малышев Н. А., Меркулова Л. Н. и др. Эффективность Ингавирина^® в лечении гриппа у взрослых. Тер архив 2009: 3: 54-57.
8. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А. и др. Изучение противовирусной активности Ингавирина^® в отношении возбудителя гриппа A (H3N2) in vitro. Антибиотики и химиотер 2009; 9-10: 23-26.
9. Галегов Г. А., Андронова В. Л., Небольсин В. Е. Изучение противовирусной активности Ингавирина^® в отношении сезонного вируса гриппа A(H1N1) в культуре клеток MDCK. Там же 2010; 9-10: 19-22.
10. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Лыков М. В. и др. Изучение эффективности Ингавирина^® in vitro в отношении «мексиканского»пандемического подтипа H1N1 вируса гриппа А, штаммы А/California/04/2009 и штаммы A/California/07/2009. Там же 2009; 3-4: 15-17.
11. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Шкляева О. М. и др. Изучение профилактической и терапевтической эффективности нового отечественного химиопрепарата Ингавирин^® в отношении возбудителя гриппа A (H5N1). Там же 2010; 7-8: 10-12.