Laryngoscope, 112:1827-1830, 2002

Кларитромицин и преднизолон подавляют продукцию цитокинов при хроническом риносинусите

Ben Wallwork, MD; William Coman, MD; Francois Feron, PhD; Alan Mackay-Sim, PhD; Anders Cervin, MD, PhD

Цели: При хроническом риносинусите эффективно длительное лечение низкими дозами макролидов. В исследовании было изучено влияние кларитромицина и преднизолона на продукцию IL-5, IL-8 и гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) в культурах слизистой носовой полости больных хроническим синуситом.

Дизайн и методы исследования: Взятые у 11 больных хроническим синуситом образцы слизистой культивировали в течение 24 часов с преднизолоном или кларитромицином в серии концентраций. Уровни цитокинов определяли твердофазным иммуноферментным анализом.

Результаты: Оба препарата обусловили значительное и сравнимое снижение продукции IL-5, IL-8 и ГМ-КСФ.

Заключение: Макролиды подавляют продукцию провоспалительных цитокинов in vitro с эффективностью, не уступающей преднизолону. Этот механизм частично объясняет клиническую эффективность макролидов при хронических синуситах.

Ключевые слова: Макролиды, преднизолон, синусит, твердофазный иммуносрбентный анализ, цитокин.

Введение

По данным исследований длительное лечение низкими дозами макролидов эффективно при хроническом риносинусите примерно у 70% пациентов. ^1,2 Эту эффективность нельзя объяснить только антибактериальным действием препаратов^3,4 при этом накапливаются доказательства наличия у макролидов противовоспалительного действия, механизм которого пока неясен. ⁵

Цитокины представляют собой молекулы пептидов или гликопротеинов, исполняющих функции межклеточных сигналов в иммунных и воспалительных реакциях. Цитокины регулируют процессы роста, дифференциации, активации и миграции иммунных клеток. При хроническом синусите обычно увеличено содержание IL-5 и ГМ-КСФ, ⁶ ответственных за эозинофильное воспаление, и IL-8, эффективного хемоаттрактанта нейтрофилов. ⁷

В настоящее время препаратами выбора в лечении хронических воспалительных заболеваний дыхательных путей являются кортикостероиды. Т.о., задача данного исследования - сравнение противовоспалительной эффективности макролида с эффективностью золотого стандарта и проверка гипотезы о снижении продукции цитокинов макролидами.

Материалы и методы

Пациенты

Образцы слизистой взяты у 11 пациентов с хроническим риносинуситом в ходе эндоскопической операции на синусах (6 муж. и 5 жен., возраст 27-62 года, средний 48). Диагноз обоснован наличием характерных симптомов на протяжении не менее 8 недель, и подтвержден данными КТ-исследования.

Процедуры исследования

Полученные образцы делили на 9 равных частей для исследования эффектов кларитромицина в серии 3 концентраций (в концентрациях 10-⁵ моль/л, 10-⁶ моль/л и 10-⁷ моль/л + контроль с метанолом), и преднизолона в серии 4 концентраций (10 -⁴ моль/л, 10 -⁵ моль/л, 10-⁶ моль/л и 10-⁷ моль/л + контроль с этанолом). После 24 час. инкубации (37°C и 5% CO₂) и теста на жизнеспособность клеток к испытуемым образцам добавили ингибитор протеаз, провели гомогенизацию, центрифугирование (10 мин, 3000 об/мин), собрали супернатант и заморозили при -80°C.

Концентрации IL-5, IL-8 и ГМ-КСФ в образцах определяли с помощью коммерческих наборов ELISA для твердофазного иммуносорбентного анализа, с порогами чувствительности 4 пг/мл для IL-5, 5 пг/мл для IL-8 и 1.25 пг/мл для ГМ-КСФ.

Содержание общего белка (в мг) в супернатанте определяли с помощью системы BioRad protein assay (BioRad Laboratories, Richmond, VA).

Содержание цитокинов определялось в пикограммах (пг) на мг общего белка в одном мл.

Статистический анализ

Для определения зависимости подавления продукции цитокинов от концентрации препаратов использовали дисперсионный анализ ANOVA логарифмически преобразованных данных. Знаково-ранговый критерий Вилкоксона использовали для выявления существенной разницы между кларитромицином и преднизолоном в подавлении синтеза цитокинов. Статистически значимым считали значение р<0,05. Результаты даны как среднее ± стандартное отклонение (средняя ошибка измерения)

РЕЗУЛЬТАТЫ

Продукция Интерлейкина-5

Зависимость снижения продукции IL-5 от концентрации кларитромицина в образцах слизистой была существенной (F_{1_10} = 5.627, P <0,039). Максимальное снижение - на 67%± 9% по сравнению с контролем - наблюдали при концентрации 10 -⁶ моль/л.

Аналогичным был эффект преднизолона (F_{1_10} = 8.986, P <0,013), с максимальным снижением на 59% ± 18% при концентрации 10-⁵ моль/л (Рисунок 1).

Рисунок 1 Продукция Интерлейкина-5 в присутствии кларитромицина и преднизолона в сравнении с контролем. Наблюдали статистически-значимую линейную зависимость снижения продукции IL-5 от концентрации кларитромицина (P <0.039) и преднизолона (P <0.013). (На оси y -уровни экспрессии цитокинов в пикограммах на миллиграмм общего белка)

Продукция Интерлейкина-8

Снижение продукции IL-8 существенно прогрессировало по мере нарастания концентрации кларитромицина (F_{1_10} = 10.479, P <0.009). Максимальное снижение - на 34% ± 16% - отмечали при концентрации 10-⁵ моль/л. Преднизолон также обусловил значительное снижение продукции IL-8 (F_{1_10} = 11.578, P <0.007). При концентрации 10-⁵ моль/л снижение продукции IL-8 по сравнению с контролем составило 45% ± 13% (Рисунок 2).

Рисунок 2. Продукция Интерлейкина-8 в присутствии кларитромицина и преднизолона в сравнении с контролем. Наблюдали статистически-значимую линейную зависимость снижения продукции IL-8 от концентрации кларитромицина (P <0.009) и преднизолона (P <0.007). (На оси y -уровни экспрессии цитокинов в пикограммах на миллиграмм общего белка)

Продукция гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ)

Концентрация кларитромицина оказывала существенное влияние на продукцию ГМ-КСФ (F_{1_10} = 8.165, P <0.017). Максимальное снижение продукции ГМ-КСФ составило 55% ± 13% при С = 10-⁵ моль/л. Аналогичный паттерн характерен и для преднизолона - (F_{1_10} = 7.021, P <0.024) с максимальным снижением на 59% ± 16% при концентрации 10-⁴ моль/л (Рисунок 3).

Рисунок 3. Продукция гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) в присутствии кларитромицина и преднизолона в сравнении с контролем. Наблюдали статистически-значимую линейную зависимость снижения продукции ГМ-КСФ от концентрации кларитромицина (P <0.017) и преднизолона (P <0.024). (На оси y -уровни экспрессии цитокинов в пикограммах на миллиграмм общего белка)

Тест Вилкоксона не выявил существенной разницы между кларитромицином и преднизолоном в подавлении синтеза цитокинов

ОБСУЖДЕНИЕ

В этой модели in vitro исследования, максимально приближенной к условиям in vivo показано, что кларитромицин в концентрациях, аналогичных сывороточным при пероральном приеме, в значительной мере подавляет продукцию IL-5, IL-8 и ГМ-КСФ. ⁸ В отличие от других исследований (только на клеточных линиях), в исследуемых образцах слизистой был сохранен полный набор клеточных элементов с присущим спектром межклеточных взаимодействий.

Цитокины синтезируются несколькими типами клеток и являются ключевыми регуляторами воспалительного процесса, управляя ростом, миграцией, дифференциацией и функционированием иммунных клеток. ⁹ Новейшие данные свидетельствуют, что цитокины задействованы в поддержании избыточного, хронического воспаления, в том числе - хронического риносинусита с повышением концентраций хемоаттрактанта нейтрофилов IL-8, а также IL-5 и ГМ-КСФ, поддерживающих эозинофильное воспаление. ^6,7,10 Показано, что макролиды подавляют продукцию цитокинов в разных типах клеток. В частности, рокситромицин подавляет продукцию IL-8 и ГМ-КСФ в эпителии бронхов¹¹, эритромицин - продукцию ГМ-КСФ стимулированными ФНО-α и IL-1/3 легочными фибробластами¹² , а также продукцию IL-8 в слизистой носа больных хроническим риносинуситом в дозах 10 -⁵ и 10-⁶. моль/л ^13,14 эритромицин и кларитромицин снижают высвобождение IL-8 эозинофилами в дозо-зависимой манере. ¹⁵ Aoki и Kao¹⁶ отметили, что эритромицин подавляет высвобождение IL-8 T-лимфоцитами и транскрипционную активацию гена, кодирующего IL-8, а также ДНК-связывающую активность провоспалительного ядерного фактора каппа В (NF-kappaB). Т.о., макролиды снижают продукцию цитокинов путем ингибирования транскрипции цитокинового гена. В отношении IL-5 информации мало, хотя рокситромицин снижал продукцию IL-5 клетками селезенки и легких. ^17,18 Кортикостероиды также подавляют продукцию цитокинов , в частности, продукцию ГМ-КСФ и IL-5 клетками назальных полипов. ^19,20,, IL-5 при хроническом синусите ⁷, однако практически не снижают продукцию IL-8.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Т.о., макролиды подавляют продукцию цитокинов в той же мере, что и кортикостероид преднизолон с эталонным противовоспалительным эффектом. Этот механизм объясняет клиническую эффективность макролидов при лечении хронического воспаления дыхательных путей.

BIBLIOGRAPHY
1. Hashiba M, Baba S. Efficacy of long-term administration of clarithromycin in the treatment of intractable chronic sinusitis. Acta Otolaryngol Stockh (Suppl) 1996;525:73-78.
2. Kikuchi S, Suzaki H, Aoki A, Ito O, Nomura Y. Clinical effect of long-term low-dose erythromycin therapy for chronic sinusitis. Pract Otol 1991;84:41-47.
3. Nagai H, Shishido H, Yoneda R, Yamaguchi E, Tamura A, Kurashima A. Long-term low-dose administration of eryth-romycin to patients with diffuse panbronchiolitis. Respiration 1991;58:145-149.
4. Fujii T, Sato A, Chida T. Long-term effect of erythromycin therapy in patients with chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Thorax 1995;50:1246-1252.
5. Cervin A. The anti-inflammatory effect of erythromycin and its derivatives, with special reference to nasal polyposis and chronic sinusitis. Acta Otolaryngol 2001;121:83-92.
6. Wright E, Frenkiel S, Al-Ghamdi K, et al. Interleukin-4, interleukin-5, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor expression in chronic sinusitis and response to topical steroids. Otolaryngol Head Neck Surg 1998;118:490-495.
7. Lennard CM, Mann EA, Sun LL, Chang AS, Bolger WE. Interleukin-1 beta, interleukin-5, interleukin-6, interleukin-8, and tumor necrosis factor-alpha in chronic sinusitis: response to systemic corticosteroids. Am J Rhinol 2000;14:367-373.
8. Hardy DJ, Guay RP, Jones RN. Clarithromycin, a unique macrolide-a pharmacokinetic, microbiological and clinical overview. Diagn Microbial Infect Dis 1992;15:39-53.
9. Bendtzen K. Cytokines and natural regulators of cytokines. Immunol Lett 1994;42:111-123. 10. Hamilos DL, Leung DY, Huston DP, Kamil A, Wood R,
10. Hamid Q. GM-CSF, IL-5 and RANTES immunoreactivity and mRNA expression in chronic hyperplastic sinusitis with nasal polyposis (NP). Clin Exp Allergy 1998;28: 1145-1152.
11. Kawasaki S, Takizawa H, Ohtoshi T, et al. Roxithromycin inhibits cytokine production by and neutrophil attachment to human bronchial epithelial cells in vitro. Antimicrob Agents Chemother 1998;42:1499-1502.
12. Sato E, Nelson D, Koyama S, Hoyt J, Robbins R. Erythromy- cin modulates eosinophil chemotactic cytokine production by human lung fibroblasts in vitro. Antimicrob Agents Che-mother 2000;45:401-406.
13. Suzuki H, Asada Y, Ikeda K, Furukawa M, Oshima T, Takasaka T. Inhibitory effect of erythromycin on interleukin-8 secretion from exudative cells in the nasal discharge of patients with chronic sinusitis. Laryngoscope 1999;109:407-410.
14. Suzuki H, Shimomura A, Ikeda K, Furukawa M, Oshima T, Takasaka T. Inhibitory effect of macrolides on Interleukin-8 secretion from cultured human nasal epithelial cells. Laryngoscope 1997;107:1661-1666.
15. Kohyama T, Takizawa H, Kawasaki H, Akiyama N, Sato M, Ito K. Fourteen-member macrolides inhibit interleukin-8 release by human eosinophils from atopic donors. Antimi-crob Agents Chemother 1999;43:907-911.
16. Aoki Y, Kao P. Erythromycin inhibits transcriptional activa- tion of NF-kB, but not NFAT, through calcineurin-independent signalling in T cells. Antimicrob Agents Che-mother 1999;43:2678-2684.
17. Konno S, Adachi M, Asano K, Okamoto K, Takahashi T. Anti-allergic activity of roxithromycin: inhibition of interleukin-5 production from mouse T lymphocytes. Life Sci 1993;52:L25-L30.
18. Konno S, Asano K, Kurokawa M, Ikeda K, Okamoto K, Ada- chi M. Antiasthmatic activity of a macrolide antibiotic, roxithromycin: analysis of possible mechanisms in vitro and in vivo. Int Arch Allergy Immunol 1994;105:308-316.
19. Rudack C, Bachert C, Stoll W. Effect of prednisolone on cytokine synthesis in nasal polyps. J Interferon Cytokine Res 1999;19:1031-1035.
20. Mullol J, Roca-Ferrer J, Xaubet A, Raserra J, Picado C. Inhibition of GM-CSF secretion by topical corticosteroids and nedocromil sodium: a comparison study using nasal polyp epithelial cells. Respir Med 2000;94:428-431.

---

Март 2009 г.