1. Патогенетическое действие препарата Мильгамма^® композитум

1.1. Биохимическая роль бенфотиамина для нервной системы

Биологически активным веществом бенфотиамина является тиаминдифосфат (ТДФ), который ранее назывался также тиаминпирофосфатом. ТДФ - это кофермент различных многоферментных комплексов, среди которых наибольшее значение для нервных клеток имеют ферменты, участвующие в углеводном обмене. Тиамин-зависимые ключевые ферменты играют важную роль в окислительных процессах расщепления глюкозы.

Кроме того, в пентозофосфатном цикле участвует транскетолаза. Данный путь обмена веществ, который происходит в цитозоле клетки, предназначен в первую очередь для того, чтобы предоставлять пентозофосфаты (например рибозо-5-фосфат) для синтеза нуклеиновых кислот и никотинамидадениндифосфат (восстановленная форма - НАДФН), например для синтеза жирных кислот. Обратной реакцией с помощью транскетолазы 5-атомный сахар превращается в гексозу или глицеральдегид-3-фосфат. ТДФ в этой реакции выполняет роль простетической группы транскетолазы, которая переносит С₂-фрагмент. После прохождения через мембраны митохондрий пируват декарбоксилируется с образованием ацетил-КоА. Катализатором реакции служит пируват-дегидрогеназный комплекс (ПДК), а ТДФ выполняет роль кофермента. В начальном энергетическом процессе, так называемом цитратном цикле, также участвует ТДФ-зависимый фермент. При участии а-кетоглутарат-дегидрогеназы (или 2-оксоглутарат-дегидрогеназы) а-кетоглутарат декарбоксилируется, дегидрируется и превращается в сукцинил-КоА, который затем, проходя стадии фумарата и малата, снова преобразуется в оксалоацетат.

В результате проведения ряда исследований по распределению тиамина в нервной клетке был получен следующий основной факт. В цитоплазме находится только транскетолаза, в то время как пируват-дегидрогеназа и а-кетоглутарат-дегидрогеназа локализованы в митохондриях (Cooper, 1 979). На основе представлений о значении тиамина в метаболизме глюкозы сделан вывод о том, что между распределением тиамина и расщеплением глюкозы существует прямая взаимосвязь.

Такие исследования были проведены у 25 пациентов с циррозом печени (Hassan, 1991). У этих пациентов отмечалась гипергликемия и были выявлены отличающиеся от нормальных показателей параметры во время проведения орального теста толерантности к глюкозе (ОТТГ). После приема тиамина уровень глюкозы, определяемый натощак, непрерывно снижался вплоть до завершения исследования к 30-му дню (от 11 7,6±2,9 до 87,6±2,4) (p≤0,01). В ОТТГ, который выполнялся 30 дней, все показатели значительно улучшились (p≤0,01). На этом основании для улучшения утилизации глюкозы пациентам с циррозом печени рекомендуется дополнительный прием тиамина или бенфотиамина. Витамин В₆ в своей фосфорилированной форме (пиридоксаль-5'-фосфат, ПФ) является коферментом большого числа ферментов, которые участвуют в общем неокислительном обмене аминокислот. Реакцией образования Шиффова основания ПФ своей альдегидной группой присоединяются к аминогруппе аминокислот апофермента. Ферментативные реакции включают декарбоксилирование, при котором синтезируются биогенные амины (гистамин, тирамин, триптамин) или нейромедиаторы (серотонин, допамин, γ-аминомасляная кислота [ГАМК]), трансаминирование, которое происходит при анаболических и катаболических процессах обмена веществ (например, в них участвуют глутамат-оксалацетат-трансаминаза, глутамат-пируват-трансаминаза, а-кетоглутарат-трансаминаза), а также различные процессы расщепления и синтеза аминокислот. Так, например, превращение гомоцистеина в цистеин катализируется двумя ПФ-зависимыми коферментами. Кроме того, ПФ выполняет роль кофермента для гликогенфосфорилазы.

1.2. "Нетрадионная функция" бенфотиамина

Независимо от функций коферментов, тиаминтрифосфат (ТТФ) и ТДФ в клеточных мембранах проявляют также самостоятельные "нетрадиционные функции".

Этот тезис базируется на первых экспериментах, выполненных von Muralt (1 947), который после стимуляции нервов наблюдал повышенное высвобождение тиамина.

Такое высвобождение, по-видимому, является результатом гидролиза ТТФ и ТДФ. Исходя из этого, тиамину отводится функция высвобождения ацетилхолина в холинергических нервных окончаниях (Eder, 1976). У крыс с тиаминовой недостаточностью синтез ацетилхолина снижен примерно до 35% нормы и может быть нормализован путем приема тиамина (Barclay, 1980). ТТФ связан с белком натриевых каналов (Bassler, 1 992). Относительно роли ТТФ и ТДФ при возбуждении нервов постулируются две гипотезы: одна исходит из каталитической функции, обеспечивающей проницаемость мембраны для Na+, в то время как другая подчеркивает фиксацию отрицательных зарядов на внутренней поверхности мембраны (Iwata, 1982).

Тиамин связывается также с изолированными никотинергическими рецепторами. Нервная проводимость может зависеть от влияния антиметаболитов тиамина (Waldenlind, 1978). Существенное значение может иметь при этом контроль состояния натриевых каналов в аксональных мембранах, реализуемый посредством ТТФ (Schoffeniels, 1 983).

1.3. Какую роль играет бенфотиамин при сахарном диабете?

Вследствие центральной роли тиамина в метаболизме глюкозы ставится вопрос об обеспеченности тиамином или потребности в нем при патологических нарушениях обмена веществ, которые развиваются при сахарном диабете. В экспериментальном исследовании у крыс с сахарным диабетом в периферической крови и различных органах определялся уровень тиамина с тиаминовой компенсацией и без нее (Hobara, 1 983). В печени животных контрольной группы содержание тиамина оказалось наибольшим по сравнению с остальными исследованными органами. У животных с сахарным диабетом, не получавших тиаминовую компенсацию, содержание тиамина в печени было статистически достоверно сниженным (p≤0,001), в то время как в других органах оно оставалось стабильным или слегка возрастало. Согласно данным другой работы, у крыс уже после двухнедельного течения сахарного диабета наблюдалось значительное снижение концентрации тиамина в печени и сердце по сравнению с животными контрольной группы (Reddi, 1 992). Приведенные результаты указывают на то, что у животных с сахарным диабетом относительный дефицит тиамина может вызывать повышение потребности в нем.

На существование непосредственной связи между тиамином и усвоением глюкозы у больных сахарным диабетом указывают результаты следующего исследования. Известно, что при применении определеных салуретиков может индуцироваться гипергликемия, которая является обратимой и проходит после прекращения приема лекарства. У 20 больных сахарным диабетом было проведено исследование, имевшее целью установить, существует ли взаимосвязь сахарного диабета и тиамина, так как при дефиците тиамина могут происходить похожие изменения в обмене веществ (Standl, 1 968). Критерием количества применения глюкозы служил коэффициент усвоения глюкозы у пациентов, которым назначался гидрохлоротиазид (ГХТ) в сочетании с тиамином или без него. После приема ГХТ данный коэффициент значительно ухудшался по сравнению с контрольной группой (p≤0,05), в то время как дополнительный прием тиамина улучшал усвоение глюкозы (p≤0,05). Если учесть ту важнейшую роль, которую играет ТДФ в метаболизме глюкозы, то такой результат легко объясним. Вследствие повышенного уровня глюкозы в крови у больных сахарным диабетом развивается повышенная потребность в тиамине.

Результаты исследования, выполненного Berndt (1977), подтверждают эту повышенную потребность. Радиактивно меченый препарат тиамина назначался перорально, и по содержанию тиамина в моче судили о степени обеспеченности организма тиамином. Как у хронических алкоголиков, так и у обследованных больных сахарным диабетом с полиневропатией и без нее, отмечался значительно более низкий уровень выделения тиамина в сравнении со здоровыми людьми, составлявшими контрольную группу. Это является достоверным показателем наличия дефицита тиамина или повышенной потребности в нем. С помощью эритроцитарной транскетолазы (ЭТК) у 1 00 больных сахарным диабетом 1 типа определялась обеспеченность организма тиамином (Havivi, 1 990). Дефицит тиамина был выявлен у 1 8% больных сахарным диабетом, в то время как у здоровых людей аналогичная ситуация наблюдалась лишь в 1% случаев (p≤0,001).

В рамках клинического исследования 35 больных сахарным диабетом 1 и 2 типов с симптоматичной дистально симметричной полиневропатией в течение 90 суток получали бенфотиамин-содержащий комбинированный препарат (Wolf, 1995).

На 0-е, 7-е, 45-е и 90-е сутки с помощью определения а-ЭТК (коэффициент активации эритроцитарной транскетолазы) у пациентов оценивался тиаминовый статус. Значения а-ЭТК более 1,22 (Rieder, 1980) рассматриваются как пограничный уровень недостаточного обеспечения тиамином. При первом измерении не было выявлено никаких признаков тиаминового дефицита. У пациентов, получавших бенфотиамин, уже через неделю был выявлен 8-кратный и 25-кратный уровень содержания тиамина в гемолизате или плазме, (p≤0,05) - показатели, вследствие более низких значений а-ЭТК (табл. 7). Была достигнута оптимизация обеспечения тиамином в течение всего срока исследования, в то время как при назначении плацебо уже на 7-й день наблюдалось ухудшение тиаминового статуса (p≤0,05). Согласно полученным результатам, несмотря на начальные "нормальные" показатели крови, назначение бенфотиамина больным сахарным диабетом позволяет достигать у них значительного улучшения обеспеченности тиамином. Фармакодинамический эффект или клиническая эффективность бенфотиамина подтверждались в этом исследовании улучшением скорости проведения по нерву (см. главу 6).

Таблица 7. Значения а-ЭТК (среднее значение и стандартное отклонение) после приема активного препарата (n=18) и плацебо (n=17) (Wolf, 1995)

Группа больных, принимавших	а-ЭТК
	1 -е сутки	7-е сутки		45-е сутки	90-е сутки
	утро	утро	вечер	утро	утро
Активный препарат	1,11 ±0,05	1,02*o±0,01	1,02*o±0,01	1,03*o±0,01	1,03*o±0,02
Плацебо	1,11 ±0,05	1, 1 6±0,06	1,14±0,07	1, 13±0,07	1,10±0,04

* достоверные различия за сутки (p≤0,05)
o достоверные различия между группами с активным препаратом и плацебо (p≤0,05)

1.4. Антиноцицептивное действие

Наряду с описанными выше эффектами тиамину и пиридоксину может быть свойственно также антиноцицептивное действие. Такие исследования в большинстве случаев проводились в сочетании с цианокобаламином. Возможными точками приложения действия являлись непосредственно болевые рецепторы, чувствительность которых варьирует в результате влияния различных тканевых гормонов (например брадикинина) и нейропептидов. Сенсибилизация болевых рецепторов проявляется, например, как воспалительная гипералгезия (повышенная болевая чувствительность). И здесь возможна взаимосвязь, так как недостаток в тиамине и пиридоксине сопровождается симптомами воспаления кожи и слизистых оболочек. Наряду с этим в стволе головного мозга имеются несколько областей, которые через нисходящие пути в спинном мозге осуществляют тормозящее влияние на вторичный нейрон и таким образом вызывают притупление болевой чувствительности. По всей видимости, медиатором в данном случае выступает серотонин. В то время как пиридоксальфосфат участвует в синтезе серотонина в качестве кофермента, тиамин выполняет важную функцию при его депонировании и транспорте. Именно здесь, возможно, находится точка реализации анальгетического действия фармакологических доз тиамина и пиридоксина (Reeh, 1988). Антиноцицептивное действие довольно просто подтверждается в экспериментах на животных. При использовании модели, предусматривающей проведение импульсов в таламус крыс после стимуляции Nervus suralis (икроножный нерв), проявлялось отчетливое тормозящее действие вышеописанной комбинации (тиамин или пиридоксин + кобаламин). Факт того, что эффект развивался только через 1 час после внутрибрюшинного введения, позволяет сделать вывод о том, что данный эффект оказывает влияние на синтез ингибиторного медиатора (Jurna, 1988). Тест "теплого глотка" у крыс позволяет провести термически индуцированную ноцицептивную реакцию. Петлевый тест приводит в действие абдоминальную реакцию путем внутрибрюшинного введения насыщенного раствора фенилбензохинона, при этом изучается химически индуцированная ноцицептивная реакция. При использовании обеих моделей описанная выше комбинация проявляла антиноцицептивный эффект, причем каждый из компонентов самостоятельно также оказывал действие. Применение комбинации усиливало анальгезирующий эффект диклофенака или метамизола (Wild, 1988).

Весьма существенно, что эти результаты подтверждались неоднократно, в том числе и при проведении двойного слепого клинического исследования. В качестве модели в большинстве случаев выступал болевой синдром позвоночного столба, при котором комбинация витаминов В₁ и В₆ демонстрировала временами значительные преимущества как сама по себе (Schwieger, 1 988), так и в сочетании с диклофенаком (Koch, 1 991).

1.5. Регенерирующее влияние на поврежденные нервные волокна

Следует также подчеркнуть влияние высоких доз нейротропных витаминов группы B на регенерацию поврежденных нервов. При экспериментальном аллергическом неврите в первую очередь нарушается миелиновый обмен. В этом случае происходит активация фосфолипазы-A, следствием чего является чрезмерный гидролиз эфиров жирных кислот, а также оказание влияния на жидкую субстанцию миелиновых оболочек. Одновременно происходит активация ацилтрансферазы.

Одновременное применение тиамина, пиридоксина и кобаламина при использовании данной модели сопровождается более поздним и ослабленным проявлением неврологической симптоматики, причем результаты указывают на то, что при этом стимулируется "восстановительный механизм" (Woelk, 1 982). У кроликов с помощью теста криопоражения можно вызывать изолированное аксональное повреждение нервных волокон. Данная модель позволила установить, что через 21 день после поражения в дистальном регенерирующем отделе икроножного нерва число регенерированных волокон было значительно увеличено после введения вышеупомянутой комбинации витаминов (Becker, 1990). На модели экспериментального неврита у кроликов было выявлено, что парентеральное введение высоких доз тиамина, пиридоксина гидрохлорида и цианокобаламина существенно увеличивает возможность встраивания холина в поврежденные нервы. Согласно методике, радиактивно меченый холин впрыскивался внутримедуллярно. Действие комбинации витаминов могло быть основано на стимуляции аксоплазматической части транспорта структурных элементов мембраны или миелиновой оболочки, например холина.

Встраивание холина было существенно повышено по сравнению с контрольной группой, что может интерпретироваться как проявление ускоряющего действия исследуемой комбинации на регенерацию периферических нервов. Существенным моментом являлось то, что животные не имели дефицита исследуемых компонентов. Авторы пришли к заключению, что способствующие регенерации свойства тиамина, пиридоксина и цианокобаламина основаны на фармакологических эффектах, характерных для высоких доз этих витаминов, и не зависящих от их дефицита. Возможно, тиамин посредством усиления энергообеспечения в форме АТФ поддерживает аксоплазматический транспорт, в то время как пиридоксин участвует в синтезе транспортных белков, а цианокобаламин обеспечивает доставку жирных кислот для клеточных мембран и миелиновой оболочки (Reiners, 1996).

Предотвращение образования конечных продуктов ускоренного гликозилирования белков (AGE-продуктов)

Результаты самых новых исследований подтверждают, что тиамин или его фосфаты, а также витамин В₆ могут предотвращать образование конечных продуктов ускоренного гликозилирования белков (AGE-продуктов). Образование AGE-продуктов представляет собой важный патогенетически активный механизм токсичности глюкозы при сахарном диабете и диабетической полиневропатии (Brownlee, 1999 и 2001).

После инкубации клеточных культур с высокими концентрациями глюкозы (28 ммоль/л) наблюдались уменьшенная клеточная пролиферация и увеличенное образование лактата по сравнению с физиологическими концентрациями глюкозы (5,6 ммоль/л). В этих исследованиях использовались клетки сетчатки быков (BREC - bovine retinacels) и клетки эндотелия пупочной вены человека (HUVEC - human umbilikal vein endothelial). Патологические изменения при глюкозной нагрузке предотвращались в клеточных культурах путем дополнительного введения тиамина (150 ммоль/л). AGE-продукты дополнительно определялись в HUVEC. В то время как при концентрации глюкозы 28 ммоль/л образовывалось повышенное количество AGE-продуктов (p≤0,05), в клеточных культурах с добавлением тиамина происходило лишь минимальное повышение их содержания. Не отмечалось существенных различий содержания AGE-продуктов в клеточных культурах при концентрации глюкозы 5,6 ммоль/л с тиамином и без него (рис. 8). Авторы объясняют ингибирование образования AGE-продуктов как результат стимуляции тиамином - посредником окислительного расщепления глюкозы в пентозо-фосфатном и цитратном циклах (La Selva, 1 996).

Рис. 8. Образование AGE-продуктов в клетках эндотелия HUVEC при инкубации с 5,6 ммоль/л или 28 ммоль/л глюкозы (Глю) с добавлением тиамина (Тиа) 150 ммоль/л и без него (La Selva, 1996)

В одном из современных исследований изучалось влияние бенфотиамина или тиамина на клеточные культуры HUVEC при глюкозной нагрузке (28 ммоль/л). В то время как при глюкозной нагрузке наблюдалось угнетение клеточной пролиферации, при добавлении бенфотиамина или тиамина она почти нормализовалась.

В экспериментальной работе изучалось влияние тиамина и его фосфатов, а также аминогуанидина и витамина В₆ на образование AGE-продуктов при использовании в качестве субстратов альбумина бычьей сыворотки, рибонуклеазы A и метгемоглобина человека. При этом оказалось, что ТДФ и пиридоксамин, в отличие от аминогуанидина, являются более действенными ингибиторами образования AGE-продуктов (Booth, 1 996).

Отправные точки вышеназванных биоактивных веществ в сложном процессе гликозилирования более подробно изучались в последующем исследовании с использованием альбумина бычьей сыворотки и рибонуклеазы A (Booth, 1 997). Было выявлено, что на этапе "позднего гликозилирования" ТДФ и пиридоксамин способны эффективно ингибировать образование AGE-продуктов. В отличие от них, аминогуанидин не оказывал практически никакого влияния на "позднее гликозилирование".

Активация транскетолазы бенфотиамином

Бенфотиамин препятствует активации патогенетических механизмов изменения направления промежуточных продуктов распада глюкозы - фруктозо-6-фосфата и глицеральдегид-3-фосфата - в пентозо-фосфатный цикл веществ. Это происходит в результате активации транскетолазы - витамин В₁-зависимого фермента, активность которого у больных сахарным диабетом снижается. Бенфотиамин повышает активность транскетолазы до 400% и таким образом устраняет "задержку утилизации" (Brownlee, 2001 ). Метаболизм глюкозы может снова нормализоваться.

Фармакодинамика бенфотиамина основывается на множестве принципов. Новейшие данные подтверждают возможность ингибирования образования AGE-продуктов. Бенфотиамин и витамин В₆ препятствуют образованию AGE-продуктов и обеспечивают при диабетической полиневропатии возможность целенаправленного терапевтического вмешательства с помощью препарата Мильгамма^® композитум.