Опубликовано в журнале:
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 4, 2009

Мониторинг лечения пациентов с инфекцией, вызванной Mycoplasma genitalium с помощью методов ПЦР и НАСБД в реальном времени

К.б.н. А.Е. ГУЩИН¹, врач О.А. БУРЦЕВ², н.с. П.Г. РЫЖИХ¹, д.м.н., проф. М.А. ГОМБЕРГ³, к.м.н. Г.А. ШИПУЛИН^1
1НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора;
²Государственный научный центр дерматовенерологии;
³Московский государственный медико-стоматологический университет, Медсанчасть №7 ФМБА, Москва

Monitoring treatment of patients with Mycoplasma genitalium infection using PCR and NASBA in real time

A.E. GUSHCHIN¹, O.A. BURTSEV², P.G. TYZHIKH¹, M.A. GOMBERG³, G.A. SHIPULIN^1
1Central Research Institute of Epidemiology, Rospotrebnadzor;
²State Research Dermatovenerological Centre, Rosmedtekhnologii;
³State Medico-Stomatological University, Medical Station No 7, FMBA, Moscow

Ключевые слова: негонококковые уретриты (НГУ), мониторинг, Mycoplasma genitalium, джозамицин, отлеляемое из уретры, первая порция мочи (ППМ), ПЦР, НАСБА в реальном времени.

Key words: non-gonococcal urethritis (NGU), monitoring, Mycoplasma genitalium, josamycin, urethral secretion, first portion of the urine sample, PCR, NASBA in real time.

В настоящее время накоплено достаточное количество клинико-эпидемиологических наблюдений и экспериментальных данных, свидетельствующих о самостоятельной этиопатогенетической роли Mycoplasma genitalium в развитии воспалительных заболеваний урогенитального тракта мужчин и женщин. В предыдущей работе мы показали, что инфекция, вызванная М. genitalium, протекает у мужчин в большинстве случаев в манифестной форме, сопровождаясь выраженными клиническими проявлениями и жалобами пациентов, обусловливая необходимость проведения лечебных мероприятий; при этом доля уретритов, вызванных М. Genitalium, составляет по разным данным от 15 до 30% среди НГУ [1]. Однако, как показали несколько исследований, существующие в настоящий момент схемы лечения негонококковых уретритов (НГУ), эффективные в отношении основного возбудителя НГУ - Chlamydia trachomatis, оказались менее эффективны в отношении М. genitalium. Лечение тетрациклиновыми препаратами пациентов с уретритом, вызванным М. genitalium, приводило к рецидиву инфекции в 63% случаев [2], а лечение азитромицином в дозировке и по протоколу лечения хламидийного уретрита не давало эффекта в 18-28% случаев [3, 4]. В связи с этим поиск альтернативных схем лечения является важнейшей практической задачей. Результаты исследований in vitro показывают, что наиболее эффективными препаратами в отношении М. genitalium являются макролиды и некоторые фторхинолоны, однако, как уже отмечалось выше на примере лечения азитромицином, полученные данные in vitro не могут автоматически переноситься на клиническую ситуацию. Объективная оценка эффективности препарата в отношении возбудителя основывается не только на данных по чувствительности клеточной культуры клинического изолята, получаемых in vitro, но и на основании клинического и микробиологического эффекта, получаемого при лечении пациентов. Широко используемый в клинической практике для лечения различных инфекций препарат джозамицин (вилъпрафен, Астеллас Фарма) по результатам in vitro имеет высокую активность и в отношении М. genitalium, и в предыдущей работе мы продемонстрировали первые результаты, отражающие его высокую эффективность при лечении пациентов с НГУ, вызванным М. genitalium [5]. В настоящем исследовании мы предложили оценивать эффективность протокола лечения джозамицином на основании результатов динамического наблюдения, клинических и лабораторных признаков уретрита, а также скорости элиминации возбудителя при выявлении генетического материала М. genitalium - ДНК и рибосомальных РНК (рРНК) непосредственно в процессе лечения.

Целью настоящего исследования явилось изучение динамики элиминации М. genitalium у мужчин с уретритом в процессе терапии джозамицином с использованием методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и НАСБА (Nucleic Acids Sequence-Based Amplification).

Материал и методы

Пациенты. В Научно-консультативном диагностическом отделении ГНЦД Росмедтехнологий за период с декабря 2006 г. по декабрь 2008 г. были обследованы 344 пациента мужского пола в возрасте от 18 до 66 лет, обратившихся с жалобами по поводу выделений из мочеиспускательного канала и дизурических явлений или для обследования в связи с имевшимся незадолго до визита в клинику половым контактом с непостоянным партнером. При обследовании пациентов проводили сбор и анализ урологического анамнеза и анамнеза половой жизни, визуальную оценку состояния кожных покровов и слизистых оболочек органов мочеполовой системы, наличие и характер выделений из уретры.

В соответствии с установленными в Центре процедурами и нормативными документами всем пациентам назначали обычные лабораторные исследования, направленные на установление лабораторных признаков уретрита (наличие более 4 лейкоцитов в поле зрения при микроскопическом исследовании с 1000-кратном увеличением не менее чем 5 полей зрения препарата, окрашенного по Граму) и выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (ИППП) - Neisseria gonorrhoeae, С. trachomatis, Trichomonas vaginalis, а также M. genitalium. В случае обнаружения возбудителей ИППП лечение назначали в зависимости от этиологии инфекции.

Лечение пациентов с инфекцией, вызванной М. genitalium. Пациентам с инфекцией, вызванной М. genitalium, назначали джозамицин (вилъпрафен, Астеллас Фарма) в дозе 500 мг З раза в день в течение 10 дней. После окончания лечения пациентам предлагалось пройти клинический и лабораторный контроль на 28-30-й день после окончания терапии.

Мониторинг лечения пациентов с инфекцией, вызванной М. genitalium. Пациентам, у которых при скрининге была обнаружена М. genitalium и которые удовлетворяли другим критериям включения (см. ниже), было предложено принять участие в наблюдательном исследовании, направленном на изучение динамики клинических и лабораторных показателей инфекции в процессе терапии джозамицином, а также сразу после окончания терапии. Мониторинг эффективности лечения проводили согласно схеме, отраженной на рисунке. Всех пациентов, включенных в протокол мониторинга, приглашали к врачу непосредственно перед началом лечения, в процессе терапии - на 3-й и 8-й дни лечения (3 д/л и 8 д/л), а также на 2-й и 28-й дни после лечения (2 д/пл и 28 д/пл). Во время визитов у пациентов оценивали наличие жалоб и клинических проявлений инфекции, а также проводили лабораторные исследования В день визита пациентам было предложено собрать первую порцию утренней мочи в объеме 10-20 мл. На приеме у пациента получали отделяемое из уретры для микроскопического исследования и исследования молекулярно-биологическими методами.

Критерии включения. Критериями включения в протокол исследования являлись: М. genitalium;
- отсутствие гонококковой, трихомонадной и герпетической инфекций;
- отсутствие клинических признаков осложнений урогенитальной инфекции: уретропростатита, везикулита, орхоэпидидимита.

Оценка эффективности лечения и элиминации М. genitalium. Критерием эффективного лечения уретрита, вызванного М. genitalium, явилось:
- отсутствие субъективных и объективных признаков уретрита;
- количественное содержание лейкоцитов при микроскопическом исследовании менее 4 в поле зрения при исследовании не менее 5 полей зрения;
- отсутствие ДНК и рРНК М.genitаliит при исследовании с помощью методов ПЦР и НАСБА в реальном времени двух типов клинического материала-первой порции утренней мочи (ППМ) и отделяемого из уретры.

Методы ПЦР и НАСБА, используемые в мониторинге терапии. Мониторинг терапии проводился в ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора с использованием наборов реагентов для ПЦР с детекцией в реальном времени "Амплисенс Mycoplasma genitalium-FRT" и наборов реагентов для реакции транскрипционной амплификации НАСБА в реальном времени "Амплисенс Mycoplasma genitalium-РИБОТЕСТ" согласно инструкциям к указанным тест-системам.

Результаты

В процессе клинико-лабораторного обследования диагноз НГУ был установлен у 242 пациентов. Среди них инфекция, вызванная М. genitalium, была выявлена у 51 (21%) пациента. Подробная характеристика клинических проявлений большей части обследованных пациентов представлена в нашей предыдущей работе [5].

Рисунок. Мониторинг результатов лечения джозамицином (вильпрафеном).

М. genitalium, была назначена соответствующая терапия джозамицином. Данные по контролю результатов терапии были получены у 49 пациентов, которые и составили группу оценки клинической и микробиологической эффективности; 2 пациента из 51 не явились на контрольное обследование.

В протоколе мониторинга эффективности лечения, график и процедуры которого представлены на рисунке, согласились принять участие 46 пациентов М. genitalium.

В указанной группе пациентов до начала терапии у 6 человек отсутствовали жалобы и клинические проявления инфекции, из них у 2 отсутствовали и лабораторные признаки уретрита. Еще у одного пациента в отсутствие лейкоцитов в отделяемом из уретры имелись жалобы на боль при мочеиспускании.

В общем виде результаты мониторинга представлены в табл. 1.

Таблица 1. Динамика выявления клинических и лабораторных маркеров уретрита и генетических маркеров М. genitalium у 46 пациентов в процессе терапии джозамицином

Период исследования	Наличие ДНК и/или рРНК М. genitalium	Наличие клинических признаков уретрита	Наличие лабораторных признаков уретрита
До печения	46 (100%)	40 (100%)	43 (100%)
3 д/л	33 (71,7%)	26 (65%)	32 (74,4%)
8 д/л	14 (30,4%)	10 (25%)	28 (65%)
2 д/пл	6 (13%)	4 (10%)	17 (39,5%)
28 д/пл	3 (6,5%)	2 (5%)	2 (4,6%)

Следует отметить достаточно быструю нормализацию клинического статуса пациентов на фоне лечения джозамицином. К 3-му дню лечения у более 1/3 пациентов исчезли субъективные признаки инфекции, остальные пациенты (за исключением 2) отметили положительную динамику лечения и уменьшение выраженности симптомов инфекции по сравнению периодом до начала терапии. К 8-му дню лечения те или иные субъективные ощущения и слабые клинические признаки уретрита остались только у 10 (25%) пациентов. На 2-йдень после окончания терапии отмечались жалобы на незначительный зуд и дискомфорт в уретре у оставшихся 4 пациентов.

Наиболее поздним маркером инфекционно-воспалительного процесса оказался уровень лейкоцитов в отделяемом из уретры. На 2-й день после окончания лечения повышенное содержание лейкоцитов наблюдалось у 17(39,5%) человек. Однако в течение последующего периода наблюдения у всех, за исключением 2 пациентов, микроскопическая картина пришла в норму.

Для контрольного обследования на 28-й день после лечения пришли только 12 пациентов - те, у кого на 2-й день после лечения имелись повышенные уровни лейкоцитов в отделяемом из уретры. К 28-му дню ни клинических, ни лабораторных признаков уретрита, а также наличия генетических маркеров М. genitalium у них обнаружено не было.

До начала терапии, как показали результаты исследования, наличие нуклеиновых кислот М. genitalium было подтверждено у всех 46 пациентов, принявших участие в исследовании. При этом у всех указанных пациентов нуклеиновые кислоты возбудителя обнаруживались как в отделяемом из уретры, так и в ППМ. Результаты по динамике микробиологического ответа, представленные в табл. 1, свидетельствовали, что примерно у 1/3 пациентов элиминация нуклеиновых кислот М. genitalium происходит к 3-му дню терапии, а к 8-му дню лечения маркеры М. genitalium отсутствовали у 77% пациентов. На 2-й день после окончания лечения только у 6 (13%) пациентов определялись нуклеиновые кислоты возбудителя.

Результаты оценки динамики элиминации ДНК и рРНК М. genitalium в разных типах клинического материала представлена в табл. 2. Следует отметить, что до начала лечения в обоих типах клинического материала - и в отделяемом из уретры, и в ППМ - обнаруживались оба типа нуклеиновых кислот М. genitalium. В процессе лечения на разных сроках оказалась высокая доля пациентов, у которых нуклеиновые кислоты обнаруживаются только в каком-то одном типе клинического материала - либо в отделяемом из уретры, либо в ППМ. Среди пациентов, ответивших на лечение, оказалась высокой доля тех, у кого в ППМ продолжала выявляться ДНК, в то время как при тестировании отделяемого из уретры результаты ПЦР были отрицательными.

Таблица 2. Результаты сравнения частоты выявления ДНК и рРНК М.genitalium в разных типах клинического материала - соскобе из уретры и ППМ - на разных сроках лечения джозамицином

Период исследования и число пациентов	М. genitalium, результаты ПЦР			рРНК М. genitalium (НАСБА)
	У: "ДНК-" ППМ "ДНК+"	У.: "ДНК+" ППМ: "ДНК-"	У: "ДНК+" ППМ: "ДНК+"	У: "ДНК+" ППМ "ДНК+"	У: "ДНК+" ППМ "ДНК-"	У: "ДНК ->ППМ:" "ДНК+"
До лечения 46 (100%)	46 (100%)	0	0	46 (100%)	0	0
3 д/л 33 (100%)	18 (54,5%)	4 (12%)	8 (24,2%)	25 (75%)	2 (6%)	6 (18%)
8 д/л 14 (100%)	2 (14%)	2 (14%)	8 (57%)	6 (43%)	3 (21%)	3(21%)
2 д/пл 6 (100%)	2 (33%)	2 (33%)	2 (33%)	3 (50%)	2 (33%)	1 (16%)
28 д/пл 3 (6,5%)	2	0	0	3	0	0

Примечание У - отделяемое из уретры; ППМ - первая порция мочи,

Общий анализ динамики клинических, лабораторных и генетических маркеров инфекции, вызванной М. genitalium, позволил установить, что из 49 пациентов, включенных в исследование, клинический и микробиологический эффект был достигнут у 46. Рецидив инфекции был установлен у 3 пациентов на разных сроках после окончания терапии: от 2 до 14 дней. В эти сроки у пациентов возобновились жалобы, сопровождающиеся выделениями из уретры и повышением уровня лейкоцитов в отделяемом из уретры. Молекулярно-биологический анализ также подтвердил наличие нуклеиновых кислот М. genitalium.

В процессе анализа неудачи терапии 3 пациентам было назначено исследование секрета предстательной железы и УЗИ, которые позволили выявить у одного из них признаки простатита. В настоящее время мы не можем исключить простатит и у других инфицированных лиц на момент назначения терапии, тем не менее мы сочли правильным исключить из анализа оценки эффективности препарата указанного пациента и ограничиться только анализом результатов по пациентам с неосложненными формами инфекции, ассоциированной с М. genitalium. В результате клиническая и микробиологическая эффективность терапии джозамицином составила 46/48 (95,8%).

Обсуждение

В своей работе мы впервые в практике лабораторного исследования на М. genitalium предложили достаточно строгую микробиологическую оценку эффективности лечения - исследовали оба типа нуклеиновых кислот возбудителя и 2 типа клинического материала. Обнаружение какого-либо из маркеров М. genitalium (ДНК или рРНК) в отделяемом из уретры или моче мы рассматривали в пользу имеющейся инфекции.

Целесообразность такого подхода основана на следующем. Оба метода ПЦР и НАСБА обладают максимально высокой чувствительностью и специфичностью при диагностике ряда инфекций в целом и для выявления М. genitalium в частности. В то же время НАСБА имеет существенное отличие от ПЦР: в качестве мишени используются одноцепочечные молекулы рРНК В этом случае исходное количество мишеней для НАСБА в сотни и тысячи раз больше, чем для ПЦР, что позволяет рассчитывать на более высокую аналитическую чувствительность. В рамках разработки и лабораторных испытаний нами было установлено, что с помощью НАСБА можно было обнаружить возбудитель как минимум в 10 раз меньшей концентрации, чем методом ПЦР. В нашем исследовании именно методом НАСБА удалось подтвердить наличие возбудителя у одного из пациентов с рецидивом инфекции, у которого плотность обсемененности М. genitalium была столь низка, что не обнаруживалась методом ПЦР.

Вторым важным обстоятельством является то, что РНК, как хорошо известно, в отличие от ДНК являются менее стабильными молекулами и значительно быстрее разрушаются при гибели клеток, в том числе под действием антибактериальных препаратов. Это дает основание рассматривать положительные результаты НАСБА как более точный маркер наличия инфекции, по крайней мере, при лечении. В работе [6] было показано, что при лечении пациентов с С. trachomatis доксициклином ДНК возбудителя обнаруживалась на 2 нед позже после элиминации РНК Наши исследования позволили выявить у определенной группы пациентов на 3-й и 8-й день лечения рРНК, определяющуюся в том случае отрицательного анализа на ДНК возбудителя. Однако в нашем случае общая скорость элиминации нуклеиновых кислот была высокой, и уже на ранних сроках после лечения возбудитель не обнаруживался, что демонстрирует высокий антибактериальный эффект джозамицина.

Второй важной особенностью нашей работы было исследование двух типов клинического материала - отделяемого из уретры - основного вида клинического материала, исследуемого у мужчин в нашей стране при диагностике урогенитальных инфекций, и ППМ. Основанием для включения ППМ в исследование послужила работа [7], в которой на значительном клиническом материале было продемонстрировано, что при первичном обследовании пациентов на М. genitalium исследование ППМ позволило выявить большее число инфицированных В нашем исследовании у всех пациентов до начала лечения обоими методами (ПЦР и НАСБА) были получены положительные результаты как в соскобном отделяемом из уретры, так и в моче, а в процессе терапии число пациентов с отрицательными результатами ПЦР и НАСБА в соскобе и положительными в моче было выше, чем число тех, у кого нуклеиновые кислоты обнаруживались в соскобе и не обнаруживались в ППМ.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что в случае диагностики М. genitalium идеальным вариантом является исследование обоих типов клинического материала; если все же предстоит делать выбор в пользу одного из материалов, то ППМ следует рассматривать как имеющий предпочтение. Однако при этом необходимо отметить, что обязательным условием является высокая аналитическая чувствительность молекулярного теста для ППМ, поскольку в моче содержится большее, чем в соскобе, количество ингибиторов ПЦР, требующее высокоэффективных методик экстракции нуклеиновых кислот. Тест-системы, которые мы использовали в своей работе, как раз и соответствовали этим требованиям.

Полученные результаты объективно отражают высокую эффективность джозамицина при лечении инфекции, вызванной М. genitalium, исходя из высокой скорости элиминации возбудителя в процессе лечения. Из 48 пациентов с неосложненной инфекцией, вызванной М. genitalium, клинический и микробиологический ответ был получен у 46 (95,8%).

1. Европейские стандарты диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путем. М 2006
2. Falk, Fredlund Н., Jensen J.S. Tetracycline treatment does not eradicate Mycoplasma genitalium. Sex Transmit Infect 2004; 79: 3'8-3'9.
3. Gambini D., Decleva I., Lupicia L. et al. Mycoplasma genitalium in males with nongonococcal urethritis: prevalence and clinical efficacy of eradication. Sex Transmit Infect 2000; 27: 226-229.
4. Bradshaw С., Jensen J.S., Tabrizi S.N. et al. Azithromycin failure in Mycoplasma genitalium urethritis. Emerg Inf Dis 2004; 12: 149-152.
5. Бурцев О.А, Гущин А.Б., Гомберг M.A. Клинические особенности течения и лечения уретрита у мужчин, вызванного Mycoplasma genitalium. Рос журн кож вен бол 2008; 5: 1-5
6. Morre S.A., Sillekens Р. Т., Jacobs М. V. et al. Monitoring of Chlamydia trachomatis infections after antibiotic treatment using RNA detection by nucleic acid sequence based amplification. Mol Pathol 1998; 51: 149-154.
7. Jensen J.S., Bjomelius E., Dohn B. et al. Comparison of First Void Urine and Urogenital Swab Specimens for Detection of Mycoplasma genitalium and Chlamydia trachomatis by Polymerase Chain Reaction in Patients Attending a Sexually Transmitted Disease. Clin Sex Transmit Dis 2004; 31: 499-507.