Фармакогеномика и современные тенденции в лечении немелкоклеточного рака легкого
Р. Россел, А. О'Брэйт, М. Монзо, Х. М. Санчес, М. Гийо, Х. Х. Санчес, К. Арасил
Больница Жерман Триас и Пухол
Бадалона, Барселона, Испания
Обычно лечение рака носит эмпирический характер и основано скорее на клинических данных, чем на понимании механизмов чувствительности к химическим агентам. Например, схемы химиотерапии обеспечивают 30-50% ремиссий у ранее нелеченых больных, и в распоряжении врачей существует лишь немного способов прогнозирования тех больных, у которых произойдет ремиссия, и выявления тех, у которых ремиссии не будет. В результате больные часто подвергаются воздействию высокотоксических препаратов и страдают от побочных эффектов в отсутствие каких-либо положительных результатов. Существует огромное количество данных, указывающих на то, что имеются не только десятки генов-супрессоров опухолей, которые воздействуют на поведение рака легкого, но важны также и эпигенетические изменения, такие как гиперметилирование, когда функция гена оказывается выключенной без мутации. Это происходит, например, в промоторной области ключевых генов-супрессоров опухоли, таких как MGMT и MLH1, которые участвуют в формировании резистентности к цисплатину. Эта резистентность не была продемонстрирована клинически, поскольку трудно получить несколько серийных биопсий у одного и того же больного, а методы определения метилирования были разработаны лишь недавно. Необходимость получения серийных биопсий для выделения ДНК недавно была разрешена, поскольку мы знаем, что мы можем получить ДНК из сыворотки больных в любое время в ходе лечения и последующего срока наблюдения. Это обстоятельство является критически важным, поскольку цисплатин в течение длительного времени оставался главным стержнем химиотерапии. Если мы окажемся в состоянии выявлять, какие больные будут резистентны к цисплатину, мы сможем индивидуально изменять химиотерапию, поскольку недавно было показано, что эффективностью обладают и некоторые комбинации новых агентов, включая таксаны, без добавления цисплатина. Для решения этих вопросов необходимы фармакогеномные исследования.
Транскрипционный статус р53 определяет чувствительность к препаратам, влияющим на микротрубочки, причем эта чувствительность реализуется через транскрипционную регуляцию гена MAP4. Продукт гена MAP4 является мажорным белком, связанным с микротрубочками и присутствующим в клетках, не являющихся клетками нервной ткани. Повышенная экспрессия MAP4, наблюдающаяся в таких случаях, когда транскрипция гена р53 неактивна, повышает степень полимеризации микротрубочек и связывание ТАКСОЛА. Это изменение приводит к повышению чувствительности к ТАКСОЛУ. Таким образом, регулируемые через р53 изменения экспрессии MAP4 могут менять динамическую стабильность микротрубочек и воздействовать на чувствительность к препаратам, влияющим на микротрубочки. Соответственно, изменения в хемочувствительности после введения препаратов, повреждающих ДНК, не наблюдаются в клетках, несущих мутантную форму р53. Эти исследования формируют основу для будущего прицельного создания комбинированных схем лечения. Этот подход является основой испытания по последовательной химиотерапии при немелкоклеточном раке легкого, проводящегося Университетом Калифорнии в Дэвисе, и испытания последовательной химиотерапии SWOG 9806 по фазе II; оба эти испытания основаны на том факте, что агенты, повреждающие ДНК, индуцируют мутации р53, и таксаны при их последующем введении могут оказываться более эффективными.
Существует масса данных о том, что при определении стадии рака легкого обычно допускается ошибка в сторону более ранних стадий. Например, при операбельных формах немелкоклеточного рака легкого можно серьезно подозревать наличие скрытых микрометастазов. В клинической практике исследователи могут выделять опухолевую ДНК из сыворотки больных, что может быть чрезвычайно полезным для определения того, что даже на ранних стадиях заболеваниях немелкоклеточный рак легкого представляет собой диссеминированное заболевание. Первый признак микрометастазов в кровотоке был обнаружен у больных с мелкоклеточным раком легкого, когда в плазме 15 из 21 больного (71%) были обнаружены изменения микросателлитов ДНК. Изменения микросателлитов также обнаруживались в сыворотке 6 из 21 (29%) больного с плоскоклеточной карциномой головы и шеи. Мы обнаружили такие изменения в сыворотке 6 из 22 (27%) больных с немелкоклеточным раком легкого. Используя полимеразную цепную реакцию во флуоресцентном варианте и автоматический секвенатор ДНК, изменения микросателлитов были обнаружены в плазме 25 из 40 (63%) больных с карциномой почки.
Мутации K-ras также были выявлены в ДНК плазмы 9 из 15 (60%) больных раком поджелудочной железы. Интересно, что у 6 из 9 этих больных (67%) мутации K-ras в ДНК, выделенной из плазмы, исчезали после лечения. Как мутации K-ras, так и мутации р53 были обнаружены в сыворотке 10 из 25 (40%) больных раком прямой и толстой кишки. Недавно в Испании было опубликовано сообщение о присутствии мутации р53 в ДНК плазмы больных раком молочной железы и мелкоклеточным раком легкого. Мы также обнаружили гиперметилирование четырех генов супрессоров опухолей в сыворотке 11 из 15 (73%) больных после резекции немелкоклеточного рака легкого. Недавно аномалии ДНК плазмы были обнаружены у 45% больных с опухолями (НМРЛ) диаметром до 2 см.
Мы сосредоточили наши исследования, связанные с ТАКСОЛОМ, на скрининге мутации b-тубулина в экстрацеллюлярной ДНК в кровотоке. Связывающиеся с тубулином лекарственные препараты из семейства таксанов оказывают непосредственное действие путем стабилизации полимеров тубулина во время образования митотического веретена. Однако существуют более отдаленные этапы на пути апоптоза, особенно те, которые связаны с функциями митохондрий. Например, цитотоксичность ТАКСОЛА связана с фосфорилированием Bcl-2 и Raf-1; другие непосредственные эффекты ТАКСОЛА стимулируются в присутствии Bax. Откачка ТАКСОЛА из клетки нарушается в клетках с гиперэкспрессией Bax. Далее, Bcl-2 и Bcl-XL подавляют выход цитохрома с из митохондрий, в то время как обладающий стимулирующим действием на апоптоз белок Bax подавляет освобождение цитохрома с. Bax и косвенно также BAD способствуют остановке клетки на стадии G2/M b клеточного цикла после повреждения тубулина. Митохондриальный геном может играть важную роль в реакции раковых клеток на лекарственные препараты. Повышенное повреждение митохондриальной ДНК противораковыми препаратами было описано в качестве одного из механизмов цитотоксичности. В нашем более раннем исследовании мы провели секвенирование гена b-тубулина (HM40) у 49 больных с НМРЛ, получавших лечение ТАКСОЛОМ в форме монотерапии. У 16 из них (33%) присутствовали мутации в тубулине, и ни в одном случае не отмечалось реакции на ТАКСОЛ; у всех этих больных время выживания было значительно меньшим, чем у больных без мутаций по тубулину.
В настоящем исследовании для упрощения мы сосредоточили внимание на оценке клинического значения тубулиновых мутаций как одного из механизмов резистентности. В настоящее время мы проводим секвенирование всех четырех экзонов, используя три независимых ПЦР. Качественная ПЦР в реальном времени позволяет определить точное количество копий ДНК, которые подверглись амплификации. Экзоны 2 и 3 амплифицируются совместно, а экзон 4 амплифицируется в отдельной ПЦР. Мы проводим секвенирование гена НМ40 в соответствии с работой, выполненной Джианнакаку. Недавно Gonzalez-Garay и соавт. обнаружили резистентность к ТАКСОЛУ в клеточных линиях СНО, причем за резистентность отвечал кластер мутаций, влияющих на положения Leu 215, Leu 217 и Leu 228. Это наблюдение показывает, что лейциновый кластер является важным структурным мотивом для сборки микротрубочек. Далее, недавняя публикация электронной карты структуры кристалла тубулина показывает, что мутации в кодонах 215 и 217 приходятся на петлю, соединяющую спирали Н6 и Н7, в то время как мутация 228 находится в составе спирали Н7. Это та же самая область (217—231), которая под влиянием света образует сшивку с 2-(m-азидобензоил)таксолом. Недавнее уточнение кристаллической структуры тубулина подтверждает участие петли Н6—Н7 как в продольных, так и в боковых контактах. Фармакофор, состоящий из Arg 282 и Thr 274, был описан в 7BzDC-таксоловом конформере, состыкованном в электронной карте кристаллической структуры b-тубулина из А549—Т12-резистентных клеток. С другой стороны, пока не было убедительно показано, что за фенотип лекарственной устойчивости отвечает изменение экспрессии изотипов b-тубулина. Мы исследуем возможность выявления тубулиновых мутаций в ДНК из крови больных с распространенной формой немелкоклеточного рака легкого. Мы высказываем предположение, что у не дающих ремиссии больных будут обнаружены соответствующие генотипы по тубулину. Мы выделили ДНК из сыворотки периферической крови 150 больных с немелкоклеточным раком легкого и сравнили ее с ДНК, полученной от 120 контрольных лиц. ДНК выделяли из сыворотки и образцов клеток крови с использованием наборов для крови Qiagen в соответствии с протоколом, описанным для крови. Наши предварительные результаты показывают, что мутации b-тубулина были обнаружены у 18 из 30 больных. Мутации тубулина были обнаружены у 16 из 24 (66,7%) больных со стадией IIIB и IV и у двух из шести (33,3%) больных на стадии I-IIIA, у которых также присутствовала ДНК в крови. Двадцать четыре больных на стадиях IIIB и IV получали химиотерапию первой линии. Из этих 24 больных 13 получали терапию второй линии, шесть терапию третьей линии, три четвертой линии и два еще и дополнительные режимы химиотерапии. Это исследование продолжается, окончательные результаты по выживаемости отсутствуют. Резюмируя эти данные, можно сказать, что описанные мутации на экспериментальном и клиническом уровне вероятно способны создавать резистентность к ТАКСОЛУ. Наша предварительная оценка подтверждает наличие тубулиновых мутаций в ДНК сыворотки у больных с немелкоклеточным раком легкого. В экспериментальных моделях антисенс олигонуклеотиды к b-тубулину класса III резко понижали экспрессию мРНК в резистентных к ТАКСОЛУ клетках рака легкого А549-Т24. Эта экспериментальная модель открывает подход, основанный на применении антисенс-олигонуклеотидов для преодоления резистентности к ТАКСОЛУ в клетках немелкоклеточного рака легкого с гиперэкспрессией b-тубулина.
Резюмируя, следует сказать, что существует много потенциальных генов-мишеней для фармакогеномной химиотерапии. Помимо мутаций тубулина, мы анализируем характер метилирования MGMT и его связь с мутациями K-ras и down-регулирование гомеобоксного гена-репрессора опухоли Cdx-2. Другими потенциальными генами-мишенями для гиперметилирования являются тромбоспондин-1, который представляет собой ингибитор ангиогенеза, регулируемый р53 и Rb, версикан, ген которого регулируется Rb, а-тубулин и hMLH1. В рамках теоретических моделей по созданию индивидуализированной химиотерапии мы можем предвидеть, что одной из основных задач будет варьирование нагрузки на ДНК от исходных моментов лечения до завершения.
Неоадъювантная химиотерапия исследуется при НМРЛ на стадиях I-II. Однако целесообразно стремиться к лучшей оценке прогноза, и технический прогресс может позволить выявлять микрометастазы на молекулярном уровне. Периодическая проверка наличия ДНК в сыворотке может исключить присутствие микрометастазов в кровотоке до и после неоадъювантной химиотерапии, а также до и после хирургической операции. Испанская группа по раку легкого (SLCG) и швейцарская группа по раку легкого (SAKK) планируют провести европейское рандомизированное испытание, в котором больные на стадиях НМРЛ I-II будут получать неоадъювантную химиотерапию (ТАКСОЛ 200 мг/м2+карбоплатин по критерию площади под кривой концентрация-время [AUC] 6 ), после чего будет выполняться хирургическая операция или же будет проводиться хирургическая операция с последующими тремя курсами той же схемы химиотерапии. В этом испытании сформулированы восемь конкретных генетических целей: (1) провести скрининг на мутации тубулина; (2) выявить корреляцию между тубулином и K-ras с рецидивами и выживанием; (3) исследовать потерю гетерозиготности по локусу 9p21; (4) провести испытание информативности редких аллелей H-RAS1 VNTR; (5) выявить остаточное заболевание; (6) установить корреляцию между генетическими дефектами с одной стороны и рецидивированием и выживаемостью с другой; (7) исследовать гиперметилирование p16, MGMT, MLH1 и тромбоспондина-1; (8) выяснить, будет ли мутация K-ras, присутствующая до начала лечения, исчезать после проведения химиотерапии. Для анализа наличия изменений в ДНК, находящейся в кровотоке, будет использована общая линейная модель. В будущем генотипирование лекарственной резистентности ДНК сможет привести к индивидуализации химиотерапии у больных, дающих рецидив заболевания.
| Май 2003 г. |
